マイクロアレイスクリーニングによる細菌忌避ポリマーのハイスループット同定

要約

出典: Venkateswaran、S.、 他。医療機器用細菌忌避ポリマーのハイスループット同定 J. Vis. 経験。 (2016年)

このビデオでは、混合細菌培養物に曝露されたマイクロアレイスライドを使用して、細菌忌避性ポリマーを同定するハイスループットの方法を示します。細菌の結合はDAPI蛍光によって評価され、シグナルの低下は表面付着が最小限に抑えられたポリマーを示します。

プロトコル

1. 高分子マイクロアレイに細菌を接種する

手記： 良好な無菌技術を確保してください。培養物のすべての取り扱いは、ブンゼンバーナーまたはフローフードのいずれかを使用して、無菌環境で行う必要があります。培養物は、酸素の利用可能性、増殖培地、および各種の要件に合わせて温度を調整して栽培する必要があります。

1. 5 mLのLuria-Bertaniブロス(LB:10 g / Lバクトトリプトン、5 g / L塩化ナトリウム、NaCl、および10 g / L酵母抽出物)をプレートのコロニーに接種して、一晩培養を調製します。37°Cで一晩インキュベートし、200 rpm(毎分回転数)で振とうします。
2. グリセロール(全体濃度10%)を添加して一晩培養の冷凍ストックを調製し、ストックを-80°Cで保存します。
3. 解凍した細菌ストックのサンプルから細胞数を決定するために、各ストックの連続希釈を実行し、固体培地上で一晩細菌を増殖させます。ストック中の細胞数を正確に測定することで、各種の適切な接種が保証されます。
4. マイクロアレイ用の接種物を準備します。単一種の培養物は上記のように増殖し、マイクロアレイに直接適用されます。BacMix-1 は、肺炎桿菌 (K. pneumoniae)、腐生ブドウ球菌 (S. saprophyticus)、および黄色ブドウ球菌 (S. aureus) の細菌混合物です。BacMix-2は、ミュータンス連鎖球菌(S. mutans)、黄色ブドウ球菌、肺炎菌、およびフェカリス腸球菌(E. faecalis)からなる細菌混合物です。
5. いずれかの混合培養物を生成するには、等量(各3ml)で一晩混合し、新鮮なLBで4回希釈します(最終容量約50mlまで)。
6. 紫外線滅菌ポリマーマイクロアレイを長方形の4ウェルプレートに入れ、6mlの混合細菌培養物と37°Cで穏やかに攪拌(30rpm)5日間インキュベートします。
7. インキュベーション後、マイクロアレイをリン酸緩衝生理食塩水(PBS:137 mM NaCl、2.7 mM塩化カリウム、KCl、10 mMリン酸水素二ナトリウム、Na₂HPO₄、1.8 mMリン酸二水素カリウム、KH₂PO₄)で2回穏やかにすすぎ、PBS中の4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色の1 μg/mlの溶液と30分間インキュベートします。
8. 染色したマイクロアレイスライドを新しいウェルプレートでPBSで覆い、穏やかに旋回させ、PBSを一度交換して洗浄します。空気の流れの下で乾燥させます。マイクロアレイスライドにガラスカバースリップを貼り付け、接着剤で所定の位置に密閉します。乾燥したら、70%(v/v)エタノールで外面を滅菌します。
9. 封じ込めレベルに応じて培養物を安全に廃棄してください。

2. マイクロアレイのイメージングと分析

1. 明視野およびDAPI(励起/発光、Ex/Em = 358 nm / 361 nm)チャネルの各ポリマースポットの単一の画像をキャプチャします。これは、蛍光顕微鏡で手動で行うか、20倍対物レンズを取り付けた自動蛍光顕微鏡(画像取得ソフトウェアによって制御されるX-Y-Zステージを搭載)を使用して行います。
   手記： 顕微鏡を調整して、明視野とDAPIチャネルを使用して画像を取得します。すべてのマイクロアレイの画像キャプチャのゲインと露光時間が同じであることを確認します。
2. スポット領域を選択し、画像処理ソフトウェアで蛍光を定量化することで、DAPIチャネル内の各スポットの平均蛍光強度を取得します。
3. 各スポットのバックグラウンド蛍光については、細菌を含まない培地のみでインキュベートした複製マイクロアレイ上のポリマースポットの画像を取得します。スポットの強度からバックグラウンド蛍光を差し引いて、細菌から蛍光を取得します。
4. さまざまなポリマーの細菌結合を比較するために使用される、各ポリマーを表す4つのスポットから平均正規化された値を計算します。
5. 細菌の結合が最も少ない(蛍光が最も低い)ポリマーを「ヒット」ポリマーとして特定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シラン調製スライド	シグマ	S4651
ポリマー	社内で合成	該当なし
LBブロス	オキソイド	CM1018
DAPIの	サーモフィッシャー	D1306
(3-アミノプロピル)トリエトキシシランコーティングスライドガラス	シグマ	シラン製剤
備品
マイクロアレイ顕微鏡	インスター	先駆者
共焦点顕微鏡	ライカ	SP5
画像解析ソフトウェア	メディアサイバネティクス	イメージプロプラス