分子分析のための水サンプルからの抗生物質耐性菌の単離

要約

出典: Ghadigaonkar、D.およびRath、A.水系抗生物質耐性菌の単離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価。 J. Vis. 経験。 (2023年)

このビデオでは、選択培地を使用して水サンプルから抗生物質耐性菌を分離および調製する方法を示します。抗生物質耐性菌からDNAを抽出し、増幅して細菌の抗生物質耐性遺伝子を同定します。

プロトコル

1. サンプルの収集と処理

1. サンプル収集
   1. 適切な量の水サンプルを滅菌サンプル容器に収集し、容器の 3/4 以下が満たされないようにします。
   2. サンプルは、収集後できるだけ早く無菌条件下で実験室に輸送し、すぐに処理します。
2. サンプル処理
   1. 滅菌モスリンクロスで水サンプルを無菌ろ過し、粒子状物質を除去します。
   2. さらなる分析のために、ろ過水の適切な段階希釈を実行します。

2. 総細菌負荷と抗生物質耐性菌数の推定

1. 総細菌負荷の決定
   1. 18.12 gのReasonerの2A寒天(R2A寒天)変質粉末を1,000 mLの二重蒸留水に懸濁し、加熱して混合物を溶解します。溶解した混合物を121°C、15ポンド/平方インチ(psi)で20分間オートクレーブします。適切な量のオートクレーブ混合物を滅菌ペトリプレートに注ぎ、R2A寒天修飾プレートを調製します(たとえば、約20 mLのオートクレーブ滅菌滅菌培地を90 mm滅菌ペトリプレートに加えます)。
   2. 培地が固まったら、ろ過水サンプルの適切な希釈液100 μLをR2A寒天、改質プレートに均一に広げます。実験を二重に分けて実行します。
   3. 上記のすべてのプレートを35〜37°Cで48時間インキュベートします(単離に使用する培地に応じて温度とインキュベーション時間を変化させます)。
   4. 式(1)を使用して、ミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU / mL)で総細菌負荷を表します。
2. AR細菌数の測定
   1. 手順 2.1.1 から 2.1.4 に従います。ただし、R2A 寒天培地の代わりに、R2A 寒天培地、5 つの異なる抗生物質、すなわちセフォタキシム (3 μg/mL)、シプロフロキサシン (0.5 μg/mL)、エリスロマイシン (20 μg/mL)、カナマイシン (15 μg/mL)、およびバンコマイシン (3 μg/mL) を個別に添加した改変プレートを使用します。
   2. ステップ2.2.1で述べた最終抗生物質濃度を達成するために、20 mLの滅菌溶融R2A寒天培地(溶融R2A寒天培地の温度で、≤40°Cで修飾)を含むチューブに抗生物質を個別に追加します。
   3. 均一に混合するために渦巻き、寒天が固まる前に滅菌ペトリプレートに注ぎます。実験を二重に分けて実行します。
   4. 上記のすべてのプレートを35〜37°Cで48時間インキュベートします(異なる培地を使用する場合、温度とインキュベーション時間は異なる場合があります)。
   5. 抗生物質の品質管理と有効性のチェックのために、大 腸菌 ATCC 25922および 黄色ブドウ球菌 ATCC 29213株の細菌懸濁液100 μLを、それぞれの抗生物質を含むR2A寒天培地、改変プレートに広げます(接種に使用される新鮮培養物の密度が光学密度、OD = 0.5、600 nmで)。
   6. ステップ2.1.4で説明されているように、抗生物質耐性菌数をCFU / mLで決定します。

3. 16SリボソームRNA(rRNA)遺伝子配列決定による培養可能細菌の同定

1. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のための分離株からのDNAテンプレートの調製
   1. 滅菌つまようじを使用して、ペトリプレート上で成長している分離株の単一の単離された純粋なコロニーを取ります。細菌コロニーを滅菌微量遠心チューブ内の100 μLの滅菌二重蒸留水に懸濁し、10分間沸騰させます。
   2. 懸濁液を10,000 × g で2分間遠心分離して破片をペレット化し、上清を新鮮な滅菌微量遠心チューブに移して粗DNAテンプレートとして使用します。
2. 16S rRNA遺伝子のV3領域の標的PCR増幅とシーケンシング
   1. 表1に示すように、PCR増幅のためにPCRチューブに40 μLの反応混合物を調製します。
      手記： DNA調製は、汚染の可能性を最小限に抑えながら、氷ブロック上で行う必要があります(試薬を取り扱うときは手袋を着用し、作業面を70%エタノールで徹底的に洗浄してください)。
   2. チューブをサーマルブロックに入れ、PCRサーマルサイクラーで適切なプログラムを実行します。標準化されたPCRサイクル条件と、16S rRNA遺伝子のV3領域の増幅に関するプライマー情報については、 表2 を参照してください。

表1:PCRマスターミックス成分。 各種PCR試薬の反応混合物組成

PCR試薬	容量(μL)
2x Taqマスターミックス	20
フォワードプライマー(10ピコモル)	1.5
リバースプライマー(10ピコモル)	1.5
粗DNAテンプレート	1.5
滅菌分子生物学水	15.5
総ボリューム	40

 

 

 

 

 

 

 

表2:16S rRNA遺伝子の増幅のためのPCRサイクル条件。 16S rRNA遺伝子増幅に必要なPCRサイクル条件を示します。ステップには、最初の変性ステップ、それに続く変性、アニーリング、および伸長の35サイクル、および最後の伸長ステップが含まれます。

方向	プライマーシーケンス5' – 3'	PCR条件	いいえ。サイクル数
フォワード	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94°Cで10分間	1
		94°Cで30秒間変性	35
		50°Cで30秒間焼きなまし
		72°Cで40秒間延長
逆	CTACCGGGGTATCTAATCC	72°Cで5分間最終伸長	1

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2x PCR Taqマスターミックス	ハイメディア	MBT061-50R型	PCR反応混合物の製造用
37°Cインキュベーター	GS-192、ガヤトリ・サイエンティフィック	NA	細菌のインキュベーション用
オートクレーブ	エクイトロン	NA	培地、ガラス板、試験管などの滅菌に必要
Bisafety B2キャビネット	IMSET	IMSET BSC-クラスIIタイプB2	細菌培養、ASTなどの微生物学的作業に使用されます。
セフォタキシム抗生物質粉末	ハイメディア	TC352-5G	抗生物質耐性菌の単離時に必要な抗生物質原液の調製用
遠心分離機ミニスピン	エッペンドルフ	ミニスピンプラス-5453	粗DNA調製中に破片をペレット化するために使用
シプロフロキサシン抗生物質粉末	ハイメディア	TC447-5G	抗生物質耐性菌の単離時に必要な抗生物質原液の調製用
測 色 計	探求	NA	培養懸濁液のODを確認するため
冷却シェーカーインキュベーター	BTL41 アライド・サイエンティフィック	NA	細菌培養用培地プレートのインキュベーション用
エリスロマイシン抗生物質粉末	ハイメディア	CMS528-1G	抗生物質耐性菌の単離時に必要な抗生物質原液の調製用
エリスロマイシン抗生物質粉末	ハイメディア	TC024-5G	抗生物質耐性菌の単離時に必要な抗生物質原液の調製用
カナマイシン抗生物質粉末	ハイメディア	MB105-5G	抗生物質耐性菌の単離時に必要な抗生物質原液の調製用
ルリア・ベルタニ・ブロス	ヒメディア	M1245-500G	文化の豊かさのために
R2A寒天、改質	ハイメディア	M1743	総抗生物質耐性(AR)細菌負荷を単離するための培地プレートの調製用
塩化ナトリウム	ハイメディア	TC046-500G	水サンプルを連続希釈するための0.85%生理食塩水の調製用
黄色ブドウ球菌 亜種 ATCC 29213	ハイメディア	0365P	ASTの実行中にコントロールとして使用
バンコマイシン抗生物質粉末	ハイメディア	CMS217	抗生物質耐性菌の単離時に必要な抗生物質原液の調製用
計量天びん	メトラー・トレド	ME204 メトラー・トレド	培地粉末、試薬粉末などの計量に使用されます。