植物宿主と相互作用する細菌の分子応答を研究するための共培養システム

要約

出典: Nathoo、N.、 et al.植物/微生物の分子相互作用とシグナル伝達の同時かつ体系的な解析のための水耕共栽培システム J. Vis. 経験。 (2017)。

このビデオは、無菌条件下での植物と細菌の相互作用を研究するための水耕栽培共栽培システムを示しています。植物の苗木は、 アグロバクテリウムを接種する前に、無菌の酸性増殖培地に移され、インキュベートされ、汚染がないか検査されます。活性化された細菌は植物の根に付着し、T-DNAを植物細胞に導入し、細菌のコロニー形成を促進する分子変化を促進します。

プロトコル

1. 水耕栽培共耕栽培システム

1. 液体のMurashige and Skoog(MS)培地を調製します:2.165 g/L MS基礎塩、10 g/Lスクロース、0.25 g/L 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、および59 mL/L B5ビタミンミックス、pH 5.75。
2. 培地をオートクレーブします。滅菌蓋付きの各滅菌円筒形ガラスまたは透明プラスチックタンク(結晶皿、100 x 80 mm2)に18 mLを注ぎます。
   手記： タンクと蓋をアルミホイルで包み、オートクレーブ滅菌して滅菌します。
3. 滅菌されたフローフードで、滅菌鉗子を使用して、生後10〜14日の苗を含む各メッシュ正方形を半固体培地から水耕栽培の円筒形タンクに穏やかに移します(図1d)。多孔質サージカルテープを使用してタンクの蓋を密閉します。
4. タンク内のメッシュ上で苗木を22〜24°Cで72時間培養し、16時間の光周期で、曝気のために50rpmで振とうします(図1e)。
   手記： これにより、植物は微生物との接種(共培養)前に水耕栽培環境に適応することができます。この待機期間により、接種前に偶発的な微生物汚染が明らかになる可能性もあります。
   1. インキュベーション期間が終了する前日に次のステップを開始します。
5. アグロバクテ リウム (AB)培地(0.5%w / v酵母抽出物、0.5%w / vトリプトン、0.5%w / vスクロース、50 mM MgSO₄、pH 7.0)で28°Cで、培養物が600 nm(OD₆₀₀)で最終光学密度1.0に達するまで一晩振とうしながら、未接種のAB培地をブランクとして増殖させます。
   手記： OD₆₀₀ 1.0 は、約 10⁹ 細胞/mL に相当します。
6. A. tumefaciensを0.85%NaClの等量で3回洗浄します。同量の滅菌二重蒸留水に再懸濁します。
7. 接種する前に、苗の入ったタンクを注意深く調べて、汚染がないことを確認してください。汚染されていないタンク内の媒体は透明で透明でなければなりません。
   1. 濁った液体(汚染)のあるタンクを廃棄し、残りのタンクに番号を付けます。番号の付いた各タンクから少量(20 μL)の水耕栽培培地をサンプリングし、ルリアブロス(LB)で満たされたシャーレに置きます。皿を28°Cでインキュベートします。
8. すぐに、50 μLのA.tumefaciens懸濁液(約5 x 10⁷細胞、OD₆₀₀から推定)を番号の付いた各水耕栽培タンクに加えます。シロイヌナズナの苗木とA.tumefaciensを22〜24°Cで16時間の光周期で50rpmで振とうします(図3f)。
   1. ステップ1.7.1の斑点のあるLBプレートを調べます。タンクの無菌性を検証するために、12時間および28時間のインキュベーション後。汚染がある場合は、対応する番号の付いたタンク(細菌を接種した)をさらなる下流アッセイに使用しないでください。
9. 必要に応じて、タンクから培地のサンプルを取り出し、接種されていない対照からの培地をブランクとして含めた分光光度計を使用してOD₆₀₀を測定することにより、定期的にA.tumefaciensの成長を監視します(図2)。
   手記： 植物の病気の症状は7日後に明らかになるはずです(図3)。

結果

図1:水耕栽培の植物と微生物の共栽培システム。 左側のパネルは、水耕栽培の組み立てと運用における 6 つの主要なステップを概説するフローチャートを表しています。右のパネルは、シロイヌナズナとアグロバクテリウムの相互作用を研究する際の水耕共栽培システムの実際の実験材料、機器、および操作手順を示しています。植物または細菌のサンプリングの接種ステップと最終ステップを示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
植物の種子(シロイヌナズナ Col-0)	シロイヌナズナ生物資源センター	CS7000	https://abrc.osu.edu/order-stocks
細菌(Agrobacterium tumefaciens C58)	ワシントン大学	該当なし
標識細菌	社内		オプション、下流解析によって異なります
二重蒸留水	(いろいろ)
マイクロピペット	(いろいろ)
ムラシゲおよびスクーグ(MS)基塩	シグマ・アルドリッチ	M5524
蔗糖	(いろいろ)
MESの	(いろいろ)
ビタミンB5ミックス	シグマ・アルドリッチ	G1019
フィトアガー	(いろいろ)
深みのあるシャーレ	(いろいろ)
ステンレススチールメッシュ	フェリエワイヤーグッズカンパニー株式会社	該当なし	グレード:304;メッシュ数:40×40;ワイヤー直径:0.01
マイクロポアテープ、1インチ	3メートル	1530-1
日周性成長室	(いろいろ)
円筒形ガラスタンク、100×80 mm	パイレックス	3250	他のサイズも使用できますが、その場合は液体含有量の調整が必要になる場合があります
フローフード	(いろいろ)
鉗子	(いろいろ)
酵母エキス	(いろいろ)
トリプトン	(いろいろ)
MgSO₄	(いろいろ)
振とうインキュベーター	(いろいろ)