大 腸菌 スフェロプラストの調製

要約

出典: フィゲロア、DM、 et.al。 抗菌ペプチド局在を特徴付けるための細菌スフェロプラストとプロトプラストの生産と可視化 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、最初に細胞分裂を阻害してフィラメント化を誘導し、続いて細胞壁を酵素的に消化することにより、 大腸 菌スフェロプラストを産生する方法を示します。このプロセスには、顕微鏡観察のための適切なスフェロプラスト形成と安定性を確保するために、キレート剤、DNase、浸透圧安定剤の制御された添加が含まれます。

プロトコル

1. 溶液の調製

1. 10.34 g Tris HClおよび4.17 gのTris OHを125 mLフラスコの50 mL dH₂Oに溶解して、1 M Tris-Cl、pH 7.8を調製します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌し、室温で円錐形のチューブに保管します。
2. 0.10 g MgCl₂(95.2 g / mol)および11.98 gスクロース(342.3 g / mol)を125 mLフラスコの25 mL dH₂Oに溶解して、溶液A(20 mM MgCl₂、0.7 Mスクロース、10 mM Tris-Cl、pH 7.8)を調製します。500 μL 1 M Tris-Cl(pH 7.8)を加え、容量を50 mLに調整します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌し、室温で円錐形のチューブに保管します。
3. 0.05 g MgCl₂(95.2 g / mol)および13.69 gスクロース(342.3 g / mol)を125 mLフラスコの25 mL dH₂Oに溶解して、溶液B(10 mM MgCl₂、0.8 Mスクロース、10 mM Tris-Cl、pH 7.8)を調製します。500 μL 1 M Tris-Cl(pH 7.8)を加え、容量を50 mLに調整します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌し、室温で円錐形のチューブに保管します。
4. 13.69 gのスクロース(342.3 g / mol)を125 mLフラスコの50 mL dH₂Oに溶解して、0.8 Mスクロースを調製します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌し、室温で円錐形のチューブに保管します。
5. 50 mLフラスコ中の3 mLのdH₂Oに0.015 g DNase Iを溶解することにより、5 mg / mLのデオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)を調製します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌します。溶液をマイクロフュージチューブに分注し、-20°Cで保存します。
6. 0.698 g EDTA二ナトリウム脱水物(372.2 g / mol)を125 mLフラスコ中の15 mL dH₂Oに溶解して、0.125 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH 8.0を調製します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌し、室温で円錐形のチューブに保管します。
7. 125 mLフラスコ中の50 mLのdH₂Oに0.03 gのセファレキシン水和物(365.404 g / mol)を溶解することにより、600 μg / mLのセファレキシンを調製します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌し、4°Cの円錐形のチューブに保存します。
8. 50 mLフラスコ中の3 mLのdH₂Oに0.015 gのリゾチームを溶解することにより、5 mg / mLのリゾチームを調製します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌します。溶液をマイクロフュージチューブに分注し、-20°Cで保存します。
9. 30 gのTSBを2 Lフラスコの1 LのdH₂Oに溶解することにより、3%w / vトリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)を調製します。大 腸菌 スフェロプラストの調製に使用する25 mLまたは100 mLのTSBを含むフラスコに溶液を分注します。液体媒体を滅菌するためのオートクレーブフラスコ。滅菌TSBは、室温または4°Cで保存できます。

2. オーバーナイト培養の準備

手記： 適切な無菌技術を使用してセクション2〜3を実行します。必要に応じて、細菌株に抗生物質耐性用のプラスミドを含めて、潜在的な汚染を減らすことができます。抗生物質耐性のある株を使用する場合は、ステップ2.1および3.1〜3.2で必要な抗生物質を追加します。

1. 滅菌ピペットチップを使用して細菌の単一のコロニーを選択し、2〜3 mLの3%w / v TSBを含む14 mL培養チューブに入れることにより、一晩培養を調製します。37°Cで16〜21時間振とうしながらインキュベートします。

3. グラム陰性大腸菌スフェロプラストの調製

1. 250 mLフラスコで、一晩培養物を25 mL容量の3%w / v TSBで1:100に希釈し、溶液が600 nmで0.5〜0.8の光学密度に達するまで約2.5時間振とうしながら、細菌溶液を37°Cでインキュベートします。分光光度計を使用して光学密度を測定します。
2. 250 mLフラスコで、この培養物を30 mLの3%w / v TSBで1:10に希釈し、37°Cでインキュベートし、60 μg/mLセファレキシン(347.4 g / mol)の存在下で2.5時間振とうして、光学顕微鏡を使用して1,000倍の倍率で観察できる長さ約50〜150 μmの単一細胞フィラメントを生成します(図1B)。
3. 細菌溶液を1,500 x g、4°Cで4分間遠心分離してフィラメントを収穫します。ペレットを予約して上清をデカントして廃棄します。
4. ペレットを乱さないように注意しながら、1 mLの0.8 Mスクロースをそっと加えてフィラメントを洗浄します。1分間インキュベートし、ペレットを乱すことなく上清を廃棄します。
5. 150 μLの1 M Tris-Cl(pH 7.8)、120 μLの5 mg/mLリゾチーム、30 μLの5 mg/mL DNase I、および120 μLの0.125 M EDTAをそれぞれの順序でペレットに加え、溶液を室温で10分間インキュベートします。
6. マイクロピペットを使用して3.5で調製した溶液に1mLの溶液Aを1分かけて徐々に加え、溶液を手で穏やかに回します。溶液を室温で4分間インキュベートします。
7. 7 mLの4°C溶液Bを2本の15 mLコニカルチューブに入れます。3.6で調製した溶液をこれら2つのチューブのそれぞれに同量加えます。溶液を1,500 x g、4°Cで4分間遠心分離します。
8. 血清学的ピペットを使用して、ペレットを乱すことなく、1〜2 mLの上清を除くすべての上清を慎重に除去します。P1000マイクロピペットを使用して上下に穏やかにピペッティングして、ペレットを再懸濁します。光学顕微鏡を使用してサンプルを1,000倍の倍率で観察することにより、スフェロプラストの形成を目視で確認します(図1C)。
9. スフェロプラストを-20°Cで最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保管します。

結果

図1:大腸菌の代表的な画像。 (A)大腸菌、(B)大腸菌ヘビ、(C)大腸菌スフェロプラスト。画像は100倍の倍率で撮影されました。

材料