グラム陽性菌Bacillus megateriumからのプロトプラストの生成

要約

出典: Figueroa、DM、 et al. 抗菌ペプチド局在を特徴付けるための細菌スフェロプラストとプロトプラストの生産と可視化 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、グラム陽性菌Bacillus megateriumからプロトプラストを生成するための段階的な手順を示します。

プロトコル

1. 溶液の調製

1. 50 mLフラスコ中の3 mLのdH₂Oに0.015 gのリゾチームを溶解することにより、5 mg / mLのリゾチームを調製します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌します。溶液をマイクロフュージチューブに分注し、-20°Cで保存します。
2. 30 gのTSBを2 Lフラスコの1 LのdH₂Oに溶解することにより、3%w / vトリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)を調製します。溶液を100 mLのTSBを含むフラスコに分注し、 B.メガテリウム プロトプラストの調製に使用します。液体媒体を滅菌するためのオートクレーブフラスコ。滅菌TSBは、室温または4°Cで保存できます。
3. 34.23 gスクロース(342.3 g / mol)、0.46 gマレイン酸(116.07 g / mol)、および0.38 g MgCl₂(95.21 g / mol)を250 mLフラスコ中の100 mLのdH₂Oに溶解して、溶液C(1 Mスクロース、0.04 Mマレイン酸、0.04 M MgCl₂、pH 6.5)を調製します。pHを6.5に調整します。0.2 μmのメンブレンを備えた25 mmシリンジフィルターでろ過して滅菌し、室温で円錐形のチューブに保管します。
4. 100 mL 3% w/v TSBと100 mL溶液Cを1 Lのガラス瓶に混合して、200 mLプロトプラスト培地を調製します。溶液を滅菌し、室温で保存するためのオートクレーブ。

2. グラム陽性 B.メガテリウムプロトプラストの調製

1. 250 mLフラスコで、一晩培養物を100 mLの3%w / v TSBで1:1,000に希釈し、溶液が600 nmで0.9〜1.0の光学密度に達するまで約4.5時間振とうしながら、細菌溶液を37°Cでインキュベートします。分光光度計を使用して光学密度を測定します。
2. 液体培養物を2本の50 mLコニカルチューブに注ぎ、2,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
3. 血清学的ピペットを使用して、両方の円錐形のチューブから上清を捨てます。各ペレットを2.5 mLプロトプラスト培地に再懸濁し、再懸濁した溶液を1つの円錐形チューブに結合します。結合した再懸濁溶液を125 mLフラスコにピペットで入れます。
4. 1 mLの5 mg / mLリゾチームを加え、振とうしながら37°Cで1時間インキュベートします。
5. 光学顕微鏡を使用して1,000倍の倍率でプロトプラストの成長を監視し、球体ではなく腫れた棒状に現れる細菌などの不規則性に注意します(図1)。血清学的ピペットを使用して、溶液を15 mLのコニカルチューブに移し、2,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
6. 上清をデカントし、ペレットを5 mLのプロトプラスト培地に再懸濁します。プロトプラストを-20°Cで最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存します。

結果

図1:B.メガテリウムの代表的な画像。(A)B.メガテリウム細菌と(B)B.メガテリウムプロトプラスト。画像は100倍の倍率で撮影されました

材料