腸上皮単層を横切る大 腸菌 のトランスサイトーシスの評価

要約

出典: Islam、A.、 et al.、 新生児大 腸菌 菌血症分離株の腸経サイトーシスの評価。 J. Vis. 経験。 (2023年)

このビデオでは、トランスウェルインサート、電気抵抗測定、および細菌定量化を使用して、腸上皮単層にわたる新生児大 腸菌 のトランスサイトーシスを評価する手順を示します。

プロトコル

1.細胞の接種(実験開始)

1. ちょうど2時間後、朝の細菌培養物をシェーカーから取り出し、10分間(1,900 x g、4°C)遠心分離します。
   手記： 次のすべての手順では、増殖を最小限に抑えるために、すべての細菌懸濁液を氷上に保管してください。
2. 抗生物質を使用せずに組織培養培地(TCM)に細菌ペレットを再懸濁します。分光光度計を使用して光学濃度(OD)を0.7〜0.9に調整し、抗生物質を含まないTCMでさらに1 x 10⁶ コロニー形成単位(CFU)/ mL(約1:100希釈)の濃度に希釈します。この細菌懸濁液を使用して、100 μL容量あたり1 x 10⁵ CFUで各インサートに感染させます。
3. トランスウェルプレートにラベルを付け、各インサートに100 μLのOD調整接種物(インサートあたり合計1 x 10⁵ CFU)を感染させます。アッセイが開始されました。時刻をメモし、t = 0 hとして記録します。
4. 接種物細菌懸濁液をプレートして、トラック希釈法を使用してCFU / mLを定量し、10 μLのアリコートを正方形のLB寒天プレートにプレーティングします。

2. トランスサイトーシスの定量化

1. 接種後30分ごとに、抗生物質を含まない500 μLのTCMで新しいウェルを満たします。異なる細菌株ごとに異なる滅菌鉗子のセットを使用して、インサートをこれらの新しいウェルに移します。
2. 各インサートの使用済み収集ウェルから培地を別々のラベル付きチューブに収集します。これらのチューブを氷の上に置きます。時間点の間に、トランスウェルプレートをインキュベーターに戻します。
3. 各インサートについて、t = 0.5 h、t = 1 h、t = 1.5 h、t = 2 hから収集した培地を組み合わせ、短時間ボルテックスします。トラック希釈法を使用して収集した培地をLuria-Bertani(LB)寒天プレートにプレートし、実験の最初の2時間にトランスサイトーズされた細菌の量を定量化します。
   手記： 30分ごとに細菌を回収し、氷上に置いておくと、収集井戸内の細菌の増殖が最小限に抑えられ、測定は主にトランスサイトーシス細菌で行われます。
4. 標識されたトラック希釈LB寒天プレートを、CO₂を補充せずに37°Cの細菌インキュベーターに入れ、T84トランスウェルプレートを組織培養インキュベーターに戻します。
5. t = 4時間で、t = 2.5時間、t = 3時間、t = 3.5時間、およびt = 4時間から収集した培地を組み合わせて、手順2.3を繰り返します。
6. t = 6時間で、t = 4.5時間、t = 5時間、t = 5.5時間、およびt = 6時間から収集した培地を組み合わせて、手順2.3を繰り返します。さらに、t = 6時間で、コントロールウェルから培地をプレートします。

3. 実験終了

1. 実験終了時の経上皮電気抵抗(TEER)を測定して記録します、t = 6時間。
2. プローブを70%エタノールに10〜15分間浸して除染します。必要に応じて、インサートを廃棄するか、追加のアプリケーションのために保存/処理します。LB寒天プレートを一晩インキュベートし、他のすべての使用済み材料を消毒および/または安全に廃棄します。
3. 一晩インキュベートした後、トラック希釈LBプレート上で細菌コロニーを手動でカウントして、接種量と 大腸菌 トランスサイトーシスの量を決定します。コントロールプレートに細菌の増殖が見られないことを確認してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL滅菌コニカルチューブ	ミッドサイ	C15B型
2 mLマイクロ遠心チューブ	アバント	AVSS2000
50 mL滅菌ポリプロピレンコニカルチューブ	隼	352070
遠心機	ソルヴァル	レジェンドRT
使い捨て接種ループ	フィッシャーブランド	22363605
ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)	ギブコ	11965-084
上皮ボルト/オームメーター	世界の精密機器	エボム
インキュベーターシェーカー	ニューブランズウィック	イノーバ4080
インキュベーター	サーモサイエンティフィック	51030284	この方法では、これらのうちの3つが使用されます:1つは無菌組織培養用、1つは感染組織培養用、もう1つは細菌インキュベーション用です。
溶原性ブロス	ディフコ	244610
溶原性ブロス寒天	IBIサイエンティフィック	IB49101
分光 光度 計	ユニコ	1100RSの
T84腸細胞	アメリカ組織培養コレクション	CCL248
組織培養インサート、ポリエチレントレフタル酸塩メンブレン付き、3 μm細孔、24ウェルフォーマット	隼	353096
組織培養プレート、24ウェル	隼	353504