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方法論記事
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2025年9月26日
出典: Eggers、CHライム病スピロヘータボ レリアブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作。 J. Vis. 経験。 (2022年)
このビデオでは、抗生物質耐性遺伝子を保有する休眠バクテリオファージDNAで操作された遺伝子組み換えボ レリア・ブルグドルフェリ 培養物の調製を紹介します。抗生物質の選択とインキュベーションの後、化学的誘導剤がDNA損傷を引き起こし、耐性遺伝子を含む新しいビリオンの切除、複製、および組み立てにつながります。2回目の遠心分離と再懸濁の後、成熟したウイルス粒子を保有する細菌細胞は、下流のアプリケーションに備えることができます。
1. φBB-1生産のためのB.ブルグドルフェリ培養物の調製
3. B. burgdorferi ファージ φBB-1 の誘導
注:オートクレーブ滅菌により、すべてのガラス製品とプラスチック製品を滅菌します。オートクレーブ滅菌または0.22 μMフィルターによるろ過により、すべての溶液を滅菌します。以下の手順は15mLの容量に基づいて示されていますが、この方法は、実験の個々のニーズに応じて、より少ない容量またはより大きな容量に拡張可能です。
表1:形質導入アッセイのためのB.ブルグドルフェリクローンの培養と選択のためのBSK。ここで説明するB.ブルグドルフェリクローンの固相選択のための1x BSKおよびB.ブルグドルフェリクローンの固相選択のための1.5x BSKの製剤化と調製は、サミュエルに基づいています。の増殖をサポートするBSK(またはMKP)のさまざまな製剤 B. burgdorferi 形質導入アッセイを使用してまだテストされていません。
| コンポーネント | 1x BSK(培養用)(1 L) | 1.5x BSK(メッキ用)(1 L) |
| ウシ血清アルブミン(フラクションV) | 35グラム | 52.5グラム |
| 10x CMRL-1066 (L-グルタミンなし) | 8グラム | 12グラム |
| ネオペプトン | 4グラム | 6グラム |
| イーストレート | 1.6グラム | 2.4グラム |
| ヘペス | 4.8グラム | 7.2グラム |
| グルコース | 4グラム | 6グラム |
| クエン酸ナトリウム | 0.56グラム | 0.84グラム |
| ピルビン酸ナトリウム | 0.64グラム | 0.96グラム |
| N-アセチル-グルコサミン | 0.32グラム | 0.48グラム |
| 炭酸水素ナトリウム | 1.76グラム | 2.64グラム |
| 熱不活化正常ウサギ血清(INRS) | 66ミリットル | 99ミリリットル |
表2:異種DNAの選択と維持に使用される可能性のある抗生物質と濃度 B. burgdorferi。 このリストは、ボレリア・ブルグドルフェリで一般的に使用されている現在の抗生物質耐性マーカーに基づいています。カナマイシン、ゲンタマイシン、およびストレプトマイシンを水で調製し、0.22 μMフィルターでフィルター滅菌し、-20°Cで保存します。エリスロマイシンを95%エタノールで調製し、-20°Cで保存します。多くの研究室は、200 μg·mL-1の濃度で選択のためのカナマイシンの使用に成功したと報告しています。形質導入アッセイでゲンタマイシンとカナマイシンの両方を選択に使用する場合、400 μg·mL-1カナマイシンが使用されます。aadA遺伝子は、ストレプトマイシンとスペクチノマイシンの両方に耐性を与えます。EにaadA遺伝子を含むコンストラクトの選択のため大腸菌、100 μg・mL−1スペクチノマイシンを使用します。アミノグリコシド(カナマイシン、ゲンタマイシン、およびストレプトマイシン)はライム病の治療に臨床的に関連しないことに注意してください。ただし、エリスロマイシンは特定の状況で臨床的に使用されます。この抗生物質に対する自然耐性が報告されていますが、 B. burgdorferi 、この耐性マーカーは、ここで報告された形質導入アッセイではこれまで使用されていません。
| 抗生物質 | ストック集中 | Bb培養物中の最終濃度 |
| カナマイシン | 100 mg.mL-1 (水中) | 200-400μ g.mL-1 |
| ゲンタマイシン | 50 mg.mL-1 (水中) | 50μ g.mL-1 |
| ストレプトマイシン | 50 mg.mL-1 (水中) | 50μ g.mL-1 |
| エリスロマイシン | 2 mg.mL-1 (EtOH内) | 0.06μ g.mL-1 |
表3:B.ブルグドルフェリからのφBB-1の誘導に使用される潜在的な誘導剤と濃度。N-メチル-N′-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、マイトマイシンC、エタノール、ならびにメタノールとイソプロパノールはすべて、B.ブルグドルフェリ株CA.11-2Aで構成レベル以上のφBB-1を誘導することが実証されています。MNNGは発がん性物質と環境への危険が疑われます。注意して使用し、可燃性溶剤に溶かし、焼却して廃棄してください。マイトマイシンCは発がん性物質の疑いがあり、潜在的な環境上の危険です。化学ヒュームフードの下で注意して使用し、適切に廃棄してください。公開されたデータは、MNNGがφBB-1を誘導する最も効果的な薬剤であることを示唆していますが、この化学物質を扱うことの危険性と入手の難しさにより、特に学生にとってその使用は複雑になっています。エタノールによる誘導は、メタノールまたはイソプロパノールによる誘導よりも一貫して優れており、形質導入アッセイで最も一般的に使用されています。
| 誘導剤 | ストック濃度(溶媒) | サンプル中の最終濃度 |
| エタノール | 100%(なし) | 5% |
| マイトマイシンC | 2 mg.mL-1 (水) | 20μ g.mL-1 |
| 1-メチル-3-ニトロソ-ニトログアニジン(MNNG) | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10μ g.mL-1 |
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 Lフィルターユニット(PES、0.22 μmの孔径) | ミリポアシグマ | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mmチューブ(デュアルポジションキャップ)(ポリプロピレン) | USAサイエンティフィック | 1450-0810 | 低ボイド容積で4mLを保持(誘導用) |
| 15 mLコニカル遠心分離管(ポリプロピレン) | USAサイエンティフィック | 5618-8271 | |
| 1-メチル-3-ニトロソ-ニトログアニジン(MNNG) | ミリポアシグマ | 注意: 潜在的な発がん性物質。すぐに入手できなくなった、提供された代替品をテストしていません | |
| 5.75インチパスツールピペット(綿栓/ホウケイ酸ガラス/非滅菌) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 〒13-678-8A | 使用前のオートクレーブ |
| 50 mLコニカル遠心分離管(ポリプロピレン) | USAサイエンティフィック | 1500-1211 | |
| 無水エタノール | |||
| バクトネオペプトン | ギブコ | DF0119-17-9 | |
| バクトTCイーストレート | ギブコ | 255772 | |
| ウシ血清アルブミン(血清補充グレード) | ジェミニバイオプロダクツ | 700-104P | |
| CMRL-1066 L-グルタミンなし(粉末) | 米国生物学的 | C5900-01 | 細胞培養グレード |
| エリスロマイシン | リサーチプロダクツインターナショナル株式会社 | E57000-25.0 | |
| ゲンタマイシン試薬溶液 | ギブコ | 15750-060 | |
| グルコース(無水ブドウ糖) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP350-500 | |
| ヘペス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP310-500 | |
| 硫酸カナマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25389-94-0 | |
| Millex-GS(0.22 μMの孔径) | ミリポアシグマ | SLGSM33SS | 抗生物質やその他の少量溶液をろ過滅菌するため |
| マイトマイシンC | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP25312 | 注意: 潜在的な発がん性物質。化学ヒュームフードでのみ使用してください |
| N-アセチル-D-グルコサミン | MPバイオメディカルズLLC | 100068 | |
| ペトリ皿(100mm×15mm) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | FB0875712 | |
| ウサギ血清非無菌微量溶血若体(NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | 製造元の指示に従って熱を不活性化 |
| 炭酸水素ナトリウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP328-500 | |
| ピルビン酸ナトリウム | ミリポアシグマ | P8674-25G | |
| 硫酸ストレプトマイシン溶液 | ミリポアシグマ | S6501-50G | |
| クエン酸三ナトリウム二水和物 | ミリポアシグマ | S1804-500G | BSK用クエン酸ナトリウム |
