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注:赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現する 大腸菌 の合成が提示されています。
1. 大腸菌からのプラスミドデオキシリボ核酸(DNA)の調製
- RFP遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミドを含む大 腸菌 を解凍し、100 μg/mLのアンピシリンを含むLuria Broth(LB)寒天プレート上で大 腸菌 を37°Cで24時間増殖させます。たとえば、合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからJ10060プラスミドを使用します( 材料表を参照)。J10060プラスミドには、pBadプロモーター領域とアンピシリン耐性遺伝子の制御下にあるRFPの遺伝子が含まれています。あるいは、LB寒天プレート上で増殖する前に、 大腸菌 (ステップ3.2を参照)をプラスミドで形質転換します。
- 標準的なミニプレッププロトコル( 材料表を参照)に従って、J10060プラスミドを含む1 mLの 大腸菌 培養物からDNAを単離します。次のプロトコルの目的は、pBad プロモーターを除去し、デバイスに必要なプロモーターに置き換えることです。
- プラスミドミニプレップに続いて、消化の準備が整うまでDNAを冷凍庫に保存します。
2. 制限酵素消化
- EcoRIおよびNheI消化用の微量遠心チューブで次の反応を設定します:10 μLのJ10060プラスミドDNA(ステップ1で単離)、8 μLの水、および1 μLのバッファーと事前に混合したEcoRIおよびNheI酵素のそれぞれ1 μL( 材料 表を参照)。
- プロモーターDNAについては、EcoRIおよびNheI消化用の微量遠心チューブで次の反応を設定します:10 μLのアニールされたプロモーターDNA配列(8 μLの水、および1 μLのバッファーと事前に混合されたEcoRIおよびNheI酵素のそれぞれ1 μL)。
- アンチモン(Sb-)、鉛(Pb-)、またはトリニトロトルエン(TNT)-RFP( 材料 表を参照)の場合、オリゴヌクレオチドを緩衝液(30 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、pH 7.5、100 mM酢酸カリウム)に溶解し、等しいモル濃度でインキュベートし、94°Cに2分間加熱し、室温で徐々に冷却します)。
- ピペットを10 μLに設定して、ゆっくりと上下にピペッティングしてサンプルを混合します。
- 37°Cで30分間インキュベートします。
- 酵素を80°Cで5分間熱不活化します。
- 消化したDNAは、次のステップの準備ができるまで冷凍庫に保管します。
3.結紮と形質転換
- 結紮
- ステップ2でEcoRIとNheIで二重消化したプラスミドとプロモーターDNAを使用して、 表1 に示す反応混合物を氷上の微量遠心チューブに設定します。最後にT4 DNAリガーゼを追加します。注: 表1は 、示されたDNAサイズに対して挿入する1:3ベクターのモル比を使用したライゲーションを示しています。
- 上下にピペッティングして反応を穏やかに混合し、微量遠心分離機で短時間分離します。
- 室温で10分間インキュベートします。
- 65°Cで10分間熱不活化します。
- 変換
- 20 μLのDH5-αコンピテント 大腸菌 細胞を入れたチューブを最後の氷の結晶が消えるまで氷上で解凍します。
- 5 μLのプラスミドDNAを細胞混合物に加えます。チューブを4〜5回慎重にフリックして、細胞とDNAを混合します。
- 混合物を氷の上に2分間置きます。
- 正確に42°Cで正確に30秒間の熱ショック。混ぜないでください。
- 氷の上に2分間置きます。混ぜないでください。
- 異化物抑制(SOC)を施した室温超最適ブロス380 μLを混合物にピペットで入れます。すぐにアンピシリン(100 μg/mL)を含むLB寒天プレートに広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
- 24時間以内にプレートの成長を確認します。
- プレートをシールフィルムで密封し、次のステップの準備が整うまで冷蔵庫に保管します。
4.コロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
- 表 2に示す反応混合物をPCRチューブ(4本の反応チューブをセットアップ)に加えます。
- 上下にピペッティングして反応を穏やかに混合します。
- 黄色のピペットチップを使用して、形質転換した 大腸菌のコロニー(または非常に小さな領域)をこすります。この 大腸菌 を切片化した新しいLB/アンピシリン/寒天プレートにスワイプし、ピペットチップをPCRチューブに挿入します。ピペットチップを振って、 大腸菌 とPCRミックスを混合します。追加のコロニーについてさらに3回繰り返します。PCRチューブをPCR装置に移し、 表3に示すプログラムを使用してサーモサイクリングを開始します。
- TAE 9Tris-Acetate-EDTA)中の2%アガロースゲルを使用してゲル電気泳動を実行して、どのコロニーがプラスミドに最適にライゲーションを持っているかを決定し、それらのコロニーを新しいプレート上で増殖させます。
- テストの準備が整うまで、プレートを冷蔵庫に保管してください。化学試験用に100 μg/mLのアンピシリンを添加したLuriaブロスで液体培養物を調製します。
5. DNAシーケンシング
- 各サンプルに、5 μLのプラスミド、4 μLのシーケンシングプライマー、および3 μLの脱イオン水を加えます。
- この混合物をチューブに入れ、DNA配列決定のために送ります( 材料表を参照)。
- DNA配列解析ソフトウェアを使用して、DNA配列データを解析し、予想されるDNA配列と観察されたDNA配列を比較し、突然変異がなく、遺伝子が正しく挿入されていることを確認します。
注:大腸菌を化学センサーとして使用する方法を以下に示します。
6. 大腸菌培養物の調製
- 液体培養用の100 μg/mLアンピシリンでLBを調製します。
- センサー細菌、ポジティブコントロール*細菌、およびネガティブコントロール**細菌の液体培養を準備します。
注:*陽性対照菌:構成的プロモーターの制御下にあるRFP遺伝子を持つプラスミドを含む大腸菌。この研究では、合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリ( 材料表を参照)のプラスミドE1010が使用されました。**陰性対照菌:pBadプロモーター(合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからのプラスミドJ10060( 材料表を参照)またはRFP遺伝子を持たないプラスミドなど、別のプロモーターの制御下にあるRFP遺伝子を持つプラスミドを含む大腸菌。 - 培養物を37°C、220rpmの振とうインキュベーターに最低8時間、最大18時間入れます。濁ったスープは細菌の増殖を示しています。
7.デバイスの機能を確認するための大腸菌の滴定
注:センサーを滴定して機能を確認したら、この手順を繰り返す必要はありません。鉛、アンチモン、および2,4-DNTまたは1,3-ジニトロベンゼン(1,3-DNB)を添加した形のポジティブコントロールは、完全な滴定を必要とせずに、使用ごとにデバイスの機能をチェックできます。
- 目的の分析種の原液を10 ppmの濃度で水中で調製します。溶解度が問題になる場合は、50/50 の水/メタノール混合物を使用してください。
- 表4をガイドとして使用して、適切な数の滅菌培養チューブにラベルを付け、2 mLの培養ブロス(プロトコルステップ6から)を各チューブに入れます。
注:一般的な分析範囲を決定するには、センサー細菌で少なくとも3つの異なるレベルの分析物、ネガティブコントロールで1つのレベル、ポジティブコントロールで1つのレベルを実行します。また、金属が添加されていない各細菌のチューブが1本ある必要があります(別のタイプのネガティブコントロール)。分析範囲と検出限界をより正確に決定するには、より広い範囲の分析種濃度を使用します。 - 表4に示すように、2 mLのブロスを含むチューブに分析種ストック溶液を加え、スナップキャップを培養チューブに緩めて(チューブへの空気の流れを可能にするため)置き、培養チューブをボルテックスします。
- スナップキャップを培養チューブにゆるく置いたままにし、220 rpm、37°Cの振とうインキュベーターに少なくとも24時間入れます。
- インキュベーターからチューブを取り出し、キャップをチューブにしっかりとはめ込み、蛍光分析の準備が整うまでチューブを冷蔵庫に保管します。
8. 銃弾残留物(GSR)の化学センサーとしての大腸菌の使用
- 鉛を除去するために設計されたエタノールベースのワイプ( 材料表を参照)を使用して、指の間を含む手のすべての表面を拭きます。両手に別々のワイプを使用してください。分析まで、ワイプは適切にラベルを貼られた密封可能な袋に入れて保管してください。
- テストする表面には、大きな表面にはアルコールベースのワイプを使用し、小さな表面にはエタノールで湿らせた綿棒を使用します。
注:GSRに対するセンサーの反応を実証するために、使用済みの.40口径のカートリッジケーシングの内側をエタノールで湿らせた綿棒で拭きました。 - 清潔な手袋を着用し、アルコールで洗浄したハサミを使用して、ワイプの中央から約1cm2 のセクションを切り取ります。
- 手拭きの切り取った部分または綿棒を、2 mLのセンサー細菌が入った培養チューブに直接入れ、ブロスに浸すようにします。
- 上記の手順7.4〜7.5に従って進めます。
表 1.ライゲーション用の反応混合物、プロトコルステップ3.1.1。
| コンポーネント | 20 μL反応 |
| 10X T4 DNAリガーゼバッファー | 2 μL |
| プラスミドDNA(3 kb) | 3 μL |
| プロモーターDNA(0.7kb) | 10 μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 4 μL |
| T4 DNAリガーゼ | 1 μL |
表 2.コロニーPCRの反応混合物、プロトコルステップ4.1。
| コンポーネント | 25 μL反応 |
| 10 μMフォワードプライマー | 0.5 μL |
| 10 μMリバースプライマー | 0.5 μL |
| 1 つの Taq 2X マスターミックス | 12.5 μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 11 μL |
表 3.プロトコルステップ4.3のPCR熱サイクルパラメータ。
| 歩 | 一時 | 時間 |
| 初期変性 | 94°C | 30秒 |
| 30サイクル | 94°C | 30秒 |
| 55°Cの | 45秒 |
| 68°C | 60秒 |
| 最終延長 | 68°C | 5分 |
| 持つ | 4°Cの | |
表 4.バイオセンサーの滴定のために設定された一般的な実験、プロトコルステップ7.2。
| チューブID | 細菌 | 添加された分析種溶液の濃度(ppm) | 金属添加 | 2,000 μLブロスに添加した分析種溶液の量 | [分析物]、ppb |
| 1 | 鉛RFP | 10 | 鉛 | 2.5 | 12 |
| 2 | 鉛RFP | 10 | 鉛 | 75 | 361 |
| 3 | 鉛RFP | 10 | 鉛 | 150 | 698 |
| 4 | 鉛RFP | 0 | 何一つ | 0 | 0 |
| 5 | RFP否定 | 10 | 鉛 | 10 | 50 |
| 6 | RFPの位置 | 10 | 鉛 | 10 | 50 |