細菌の表面運動性を可視化するためのスウォーミングアッセイ

要約

出典: Morales-Soto、N. et al.、 細菌表面運動性アッセイの調製、イメージング、および定量化。 J. Vis. 経験。 (2015年)

このビデオでは、緑色の蛍光タンパク質を発現する細菌を使用して、軟寒天の表面運動性を観察する群集合アッセイを示します。タイムラプスイメージングは、協調的な拡大と巻きひげの形成を捉え、細菌の表面運動性を強調します。

プロトコル

1. スウォームアッセイ培地の調製と接種

1. 培地の準備
   手記：以下に説明する培地組成は、緑膿菌の巻きひげ形成研究に適用できます。緑膿菌、枯草菌、および Myxococcus xanthus 表面運動性アッセイについては、表 1 の培地仕様を参照してください。
   1. 200 mlの流動好気性バイオリアクター(FAB)マイナス硫酸アンモニウム((NH4)₂SO₄)スウォーム培地(材料表)、0.9 gの貴寒天、および0.2 gのカサミノ酸(表1)を磁気撹拌棒で攪拌して混合します。実験間の一貫性を高めるために、少量(100〜300 ml)を使用します。
   2. 200 ml寒天/培地混合物を、22分の暴露時間、121.1°Cの暴露温度、および高速ベントオプションを使用してオートクレーブします。オートクレーブ設定により、適切な滅菌と寒天の融解が可能になりますが、寒天のカラメル化は防止されます。
      手記： 高貴な寒天はカラメル化しやすいです。細菌の運動性は、キャラメリゼ寒天で変化します。
   3. 滅菌サイクルが終了したらすぐに、蒸発による水分の損失を防ぐためにメディアボトルのキャップを閉めてください。ただし、キャッピングをきつくすると、ボトルに「真空シール」のような効果が生じる可能性があることに注意してください。
   4. 室温(RT)で撹拌しながら培地を50°Cに冷却し、滅菌1.2Mグルコース2mlを加えます。または、培地を60°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに入れて、使用する準備ができるまで(最大15時間後)、指示に従って進めます。媒体に気泡が形成されるのを防ぐために、磁気攪拌バーを使用して完全に混合します。寒天の表面の泡は、群がることさえも防ぎます。
      手記：他のアッセイでは、必要に応じて、このステップで追加の栄養素や染料など、オートクレーブ滅菌できない熱に敏感な成分を追加します(たとえば、以下の代表的な結果に示すように、溶融寒天100mlあたり8 μlのInvitrogen Syto 63色素を使用して、M.キサンサスを画像化します)。一部の色素の添加は、ベースラインの群れの挙動に影響を与える可能性があり、非色素対照と照らし合わせる必要があります。
   5. 実験室のフードで、直径60 mmのポリスチレンペトリ皿あたり7.5 mlの滅菌培地を分注し、プレートを単層(積み重ねない)に維持します。より大きな群れの表面の場合は、直径100 mmのペトリ皿あたり25 mlの培地を分注します。均一な水平面に皿を埋めることが重要です。ブルズアイレベルを使用して、表面が水平になっているかどうかを確認します。
      手記：緑膿菌アッセイでは、プレートごとに特定の培地量を使用すると、一貫性と再現性が向上します。枯草菌および M. キサンサスアッセイの場合、手で注ぐと、特定の容量のアリコートに匹敵する結果が得られます。
2. プレート硬化
   1. 小さなプレート(60 mm)の場合、溶融した寒天培地をフード内で30分間硬化させます(半固体と乾燥した余分な液体の両方に設定)、蓋をせずに30分間待ちます。より大きなプレート(100 mm)は、より長い硬化時間を必要とします(説明を参照)。
      手記： あるいは、一部のアッセイでは、プレートを単層で覆った(つまり、蓋をした)ベンチトップで一晩(20〜24時間)硬化させる必要がある場合があります(表1)。群れは、過剰な水分と不十分な水分の両方に敏感です。特定のラボの湿度、気流、温度により、細菌の最適な群れを促進するためにプレート硬化の変動が必要になる場合があります。
   2. 乾燥期間が終わったらすぐにプレートに接種してください。プレートを保管しないでください。
      1. 0.50%(vol/vol)のヒギンズ防水ブラックインディアインクと細菌接種物の10μlの混合物でテストプレートをスポットすることにより、「インク拡散試験」を実行します。インク/接種物の混合物が培地の表面に容易に広がる(つまり、 液滴の形を保持しない)場合、培地の乾燥にはさらに時間が必要になります。
         手記：湿度に特に敏感な種 (緑膿菌など) の場合は、簡単な「インク拡散テスト」を実行して、プレートが十分に乾燥しているかどうかを判断します。
3. スウォームアッセイ接種
   1. 6 mlのブロス培地(詳細については 表1 を参照)に、新鮮な(室温で放置した場合<5日齢)溶原性ブロス(LB)プレート培養物から単離したコロニーを接種します。ブロス培養物を水平振とう(240 rpm)しながら、30°Cまたは37°Cで一晩(≤18時間)インキュベートします。
   2. 1〜5 μlの一晩ブロス培養物でスポッティングするか、滅菌つまようじまたはワイヤー接種針で寒天を「突く」ことにより、群れプレートを接種します。
      手記： 接種物が飛び散る可能性が低くなり、群れの表面積に水分が追加されるのを防ぐため、後者の方法を好みます。
4. スウォームアッセイインキュベーション
   1. 一般的なアッセイの場合、スウォームアッセイプレートを30°Cまたは37°C(または枯草菌の場合は42°C;表1)—これは細菌特異的です。インキュベーション中にプレートを反転させて、余分な水分が寒天ではなく蓋に凝縮するようにします。
      手記： 温度は表現型と動態に影響を与える可能性があります。緑 膿菌 の群れの場合、37°Cでのインキュベーションは、30°Cでのインキュベーションよりも速い成長と群れの拡大につながります。ただし、これらの群れの形態は、この温度の変化によって異なることがよくあります。
   2. タイムラプスイメージングの場合は、スウォームプレートをイメージングステーションに移す前に、適切な温度でインキュベートします(詳細については 、表1 を参照)。
      手記： このイメージング前のインキュベーションにより、群れは新しい環境に移動される前に発達を開始し、定着することができますが、これは群れの運動性にとって最適である場合とそうでない場合があります。

2. 表面運動性アッセイの巨視的イメージング

1. タイムラプスイメージングの場合、イメージング前のインキュベーション期間の後、市販の in vivo イメージングステーション内の透明なイメージングプレートにスウォームアッセイプレートを置きます。一度に最大6枚の直径60mmまたは4枚の直径100mmのプレートを撮影できます。カメラは撮像面の下から画像を撮影するため、光路が遮られないようにプレートを反転させます。あるいは、実験中は30°Cまたは37°C(表1)でインキュベートし、設定された時間間隔でイメージングするプレートをインキュベーターから取り出します。
2. ペトリ皿の蓋を、接種した培地を保持するプレートの上に直立させます。イメージング中の過度の乾燥を防ぐためにペトリ皿の蓋を水で満たし、実験中ずっと湿度を維持するために別の透明なトレイを使用してセットアップ全体を囲みます。
3. 分子イメージング(MI)ソフトウェアを使用して、 表2に記載されているイメージング設定を使用して室温でアッセイを実行します。タイムラプスイメージングの場合は、必要な手順と仕様を備えたプロトコルを設定します。

表1:表面運動性アッセイ調製の仕様。 緑 膿菌、 枯草菌、 および M. キサンサスの表面運動性アッセイ調製仕様が含まれています。

	緑膿菌	緑膿菌の巻きひげ形成研究	枯草菌	M.キサンサス
オーバーナイトブロス培地	FABプラス30 mMグルコース	FABプラス30 mMグルコース	ポンド	CTT(複合媒体)
一晩のブロス培養インキュベーション温度	37°C	37°C	37°C	30°Cで30時間
スウォームメディア	工場	FABマイナス(NH4)2SO4	2%(重量/体積)LB	CTTの
スウォームメディア:追加コンポーネント	12 mMグルコース	10%(wt / vol)カサミノ酸(CAA)、12 mMグルコース	該当なし	SYTO® 64a
寒天タイプ	寒天、高貴	寒天、高貴	造粒寒天	寒天、高貴なアフィメトリックス
寒天濃度(wt / vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
スウォームプレートサイズ	60ミリメートル	60ミリメートル	100ミリメートル	150ミリメートル
プレートあたりのメディア量	7.5ミリリットル	7.5ミリリットル	手作業で注がれた	手作業で注がれた
スウォーム培地の設定/乾燥方法	フード;プレートは覆われていない	フード;プレートは覆われていない	ベンチトッププレートを覆う	ベンチトッププレートを覆う
スウォーム培地の設定/乾燥時間	30分	30分	一晩(20 -24時間)	一晩(20 -24時間)
スウォームアッセイのインキュベーション温度	30または37°C	30°C	37°C	30°C
タイムラプスイメージングのためのインキュベーション	30°Cで4時間以上	30°Cで4時間以上	37°Cで2時間	12時間RT
タイムラプスキャプチャの長さ	24時間	24時間	10時間	66時間
タイムラプス設定	1コマ/10分	1コマ/10分	1コマ/6分	1コマ/10分
a オートクレーブ滅菌後に追加されます。

 

表2:イメージング仕様。 細菌表面増殖の赤と緑の蛍光とルミネセンスイメージングのためのBrukerイメージングステーションの仕様

信号	緑色蛍光	赤色蛍光I	赤色蛍光II	発光
タンパク質または染料	緑色蛍光タンパク質(GFP)	mCherryプロテインまたはナイルレッドラムノ脂質染色	シト® 64	ルシフェラーゼ 由来の ルシフェラーゼ
励起波長(nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	オフ
発光波長(nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	フィルターなし
露光時間(秒)	30	60	60	240
Fストップ	4.0	4.0	2.5	1.1
視野角(mm)	190	190	140	120
焦点面(mm)	27.5	27.5	12.2	4
ビニング (ピクセル)	何一つ	2 x 2	何一つ	8×8

材料