Streptomyces coelicolorの野生型株と変異株の表現型比較

要約

源： ベネット、JA、 他。 Streptomyces発生変異株の視覚的および顕微鏡的評価 J. Vis. 経験。 (2018)

このビデオは、野生型と変異型の Streptomyces coelicolor 株の培養と表現型の比較を示しています。適切なめっき技術を通じて自然変異を最小限に抑え、相互汚染を防止し、細菌の増殖を促進する手順の概要を説明します。最後に、ビデオは、細菌株の変異の発生効果を説明するために、コロニー形態の視覚的な違いを強調しています。

プロトコル

1. 器具、培地、溶液、シャーレを準備する

1. つまようじをアルミホイルで覆った50mLビーカーにオートクレーブし、無菌状態に保ちます。

2.使用するすべての乾物(チップ、スティック、ガラス製品など)をオートクレーブで滅菌します。

手記： 注意！使用するオートクレーブモデルのすべての安全指示に従ってください。オートクレーブは、爆発、蒸気による火傷、高温の表面、材料、媒体との接触の危険性がある。

3. 培養物を増殖させるためにMS寒天培地(マンニトール大豆粉(SFM))を準備します。

1.1Lのフラスコに大豆粉5gと寒天5gを加えます。

2.マンニトール5gを水道水250mLに溶かし、大豆粉と寒天の入ったフラスコに分注します。

3.フラスコの開口部にフォームプラグとホイルを追加し、121°C、15 psiで少なくとも30分間オートクレーブします。

注意： この媒体は簡単に沸騰します。オートクレーブ滅菌されるMS寒天培地の実際の容量の少なくとも4倍を保持できるフラスコを使用してください。オートクレーブの代わりに標準的な圧力鍋を使用することもできますが、同様の安全上の配慮があります。あるいは、オートクレーブにアクセスできない場合は、電子レンジを使用して培地や材料を滅菌することもできます。高校の教師は、地元の大学と協力してオートクレーブ滅菌された物資にアクセスすることもできます。

4. 扱いやすいほど快適になるまでメディアを冷却します。寒天は50°C以下で固まるので、長時間冷やさないように注意してください。

5.各ペトリ皿の底が約半分になるまで、フラスコから滅菌ペトリ皿にMS寒天を注ぎます(ペトリ皿あたり約25 mLの培地)。寒天プレートを使用する前に固化させます。寒天プレートは、必要になるまで室温でビニール袋に入れて保管してください。

手記： 寒天プレートは、特に培地に抗生物質が必要な場合は、冷蔵庫に保管することもできます。

2. ストレプトミセスをプレート上にストリークして増殖させる

1. ストリークスト レプトミセスは 、象限ストリーク法などの標準的な方法を使用して、MS寒天プレート上に単一コロニーに株を移植します。

手記： 接種ループまたは滅菌つまようじを使用できます。オプション:R2YEや最小培地など、他の培地がスト レプトミセス 種に一般的に使用されます。

2.プレートを30°Cでインキュベートします。

3.4〜6日ごとに1つのコロニーをピックアップしてプレートをリストリークします。コロニーが老化するにつれて、ランダムな突然変異を起こしやすくなります。

3. 外観の比較と記録

1.ステップ2のようにすべての株をストリーキングした後、野生型親株と比較して、各変異体のコロニー形態に注意してください。新しいストレプトミセス種を特徴付ける際に、新しい分離株をS.コエリカラーやS.ベネズエラなどのよく研究された種の分離株と比較します。基本的な形状、コロニーの表面(ぼやけ、ハゲ、しわなど)、不透明度、隆起、色素沈着(栄養菌糸体、気上菌糸体、および/または周囲の培地を区別する)などの特性(図1)に注意してください。

2. MS寒天プレートに標識し、野生型および変異株をくさびパターンでストリークします(図1)。相互汚染を避けるために、株が別の株に接触しないように注意してください。ひずみがプレートに縞模様が描かれた日付と時刻に注意してください。プレートを30°Cでインキュベートします。

3. 成長させたペトリ皿を色紙または白紙の上に置き、背景を均質化します。株名、日付、インキュベーション温度、および最初のプレートストリーキングからの時間を紙に書きます。混乱を最小限に抑えるために、紙の背景に後者の情報が書かれているプレートのデジタル写真を撮ります。

手記： 文字は、図形の準備に使用する場合は、後で写真から切り取ることができます。

結果

図1:の巨視的コロニー表現型を示す代表的な寒天プレートの写真 S. coelicolor。 寒天プレートは、発生表現型を持つさまざまなランダムトランスポゾン挿入変異体と比較して、野生型 S. coelicolor 株 MT1110 (WT) の気上菌糸体のぼやけた灰色の視覚的外観を示しています。変異体は、気上菌糸体[禿げ頭(bld)]または胞子色素沈着が減少した気上菌糸体[白(whi)]...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
滅菌水	ジーンメイト	G-3250-1L
つまようじ(フラット)	ターゲット	081-22-1957
ピペットチップ(10 mL)	ジーンメイト	P-1240-10
ピペットチップ(200 mL)	ジーンメイト	P-1240-200Y
ピペットチップ(1,250 mL)	ジーンメイト	P-1240-1250
綿棒	フィッシャーブランド	23-400-124
大豆粉	ボブのレッドミル	1516C164
D-マンニトール	シグマ・アルドリッチ	M4125-1KGの
寒天	シグマ・アルドリッチ	A1296-1KG
グリセロール100%	VWR amresco ライフサイエンス	0854-1L
0.8% NaCl (生理食塩水)	シグマ・アルドリッチ	SLBB9000V
ペトリ皿	シグマ・アルドリッチ	P5856-500EA
カバー伝票 #1.5	トーマス・サイエンティフィック	64-0721
スライド	カロライナ	63-2010
オートクレーブ	トゥットナウアー	2540円
鉗子	カロライナバイオロジカル	624504
ブンゼンバーナー	カロライナバイオロジカル	706706
メタノール	シグマ・アルドリッチ	34860-1L-R
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	シグマ・アルドリッチ	P4417-50タブ
100 mLビーカー	パイレックスUSA	1000-T
1Lビーカー	カロライナバイオロジカル	721253