ストレプトミセスにおける発生変異体を評価するための位相差顕微鏡

要約

出典:Bennett、JA他。Streptomyces発生変異株の視覚的および顕微鏡的評価J. Vis. 経験。(2018年)

このビデオでは、位相差顕微鏡を使用して、野生型と変異型の Streptomyces coelicolor の表現型の違いを調べる方法を示します。胞子形成における発生欠陥を検出するための空中フィラメントの準備とイメージングに関連する手順の概要を説明します。

プロトコル

1. 位相差顕微鏡検査を行う

1. ピンセットを70%エタノールで洗浄し、ブンゼンバーナーの炎に通してエタノールを蒸発させることで滅菌します。冷まします。
2. カバーガラスを70%エタノールで洗浄し、滅菌ペトリ皿で乾燥させることで滅菌します。
3. 検査する細菌増殖のカバーガラスリフトを準備します。
   1. 滅菌ピンセットで滅菌カバーガラスを手に取り、 Streptomyces coelicolor 細菌の増殖が密集しているマンニトール大豆粉(MS)寒天プレートにカバーガラスを置きます。カバーガラスの裏側をピンセットで軽く押して、細菌胞子と気上菌糸体が十分に移動するようにします。
4. プレートからカバーガラスを持ち上げ、細胞材料のある側が顕微鏡スライドの表面を向くように置き、15 μLの50%グリセロールを水中に調製して取り付けます。カバーガラスをスライドに対して45°の角度で置き、50%グリセロールの上に落とすことで気泡を減らします。
5. (オプション)スライドを保存するために透明なマニキュアで密封します。
6. 位相差顕微鏡検査は、ライフサイクル中のさまざまな時間間隔で実行します。
   手記： イメージングを繰り返すことで、より完全な分析が可能になり、開発の遅れを検出することができます。観察を独立して繰り返し、精度と再現性を確保します。
   1. 準備したスライドを顕微鏡ステージに置き、カバーガラスの中央に浸漬油を一滴加えます。100X位相対物レンズを所定の位置で回転させ、コンデンサータレットを適切な「一致する」位相設定に設定します。対物レンズがオイルに接触したら、微調整ノブのみを使用して画像に焦点を合わせます。
   2. 胞子を形成する能力、胞子のサイズと形状、胞子の総数など、変異株と野生型の間の顕著で一貫した違いを識別するために、いくつかの視野を調べます( 図1を参照)。
      手記： 位相差顕微鏡の代替手段には、示差干渉コントラスト(DIC)顕微鏡や、クリスタルバイオレット染色などの明視野顕微鏡で使用するための簡単な染色技術が含まれます。

結果

図1:ランダムなトランスポゾン挿入変異を含むStreptomyces coelicolor白色変異株の代表的な空中フィラメントを示す位相差顕微鏡写真。(A)示されているのは、同期的で規則的な間隔の細胞分裂を受け、均一な形状とサイズの胞子を生成した代表的な野生型空中フィラメントです(MT1110)。(B-F)残りのパネルは、ランダムなトラ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50%グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G5516
浸漬油(DF型)	クラジール	16482
滅菌水	ジーンメイト	G-3250-1L
100%エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023
大豆粉	ボブのレッドミル	1516C164
D-マンニトール	シグマ・アルドリッチ	M4125-1KGの
寒天	シグマ・アルドリッチ	A1296-1KG
グリセロール100%	VWR amresco ライフサイエンス	0854-1L
ペトリ皿	シグマ・アルドリッチ	P5856-500EA
カバー伝票 #1.5	トーマス・サイエンティフィック	64-0721
スライド	カロライナ	63-2010
位相差顕微鏡	オリンポス	BX40
鉗子	カロライナバイオロジカル	624504
ブンゼンバーナー	カロライナバイオロジカル	706706
クリアマニキュア	OPI	22001009000
顕微鏡用カメラ	オリンポス	DP72
ニトリル検査用手袋(医学用)	バイオエクセル	71011002