宿主細菌によるサッカリバクテリアの二成分培養の確立

要約

出典: Collins、AJ、 et al.、 口腔からの共生糖菌の安定した二成分培養の確立。 J.ビス。 (2021年)

このビデオは、サッカリバクテリアとその宿主細菌を宿主特異的増殖培地で順次共インキュベートすることにより、二元培養の確立と維持を示しています。

プロトコル

1. 遠心分離による糖類菌細胞濃縮
   1. チューブとキャップに向きのマークを付け、上側にマークを付けてチューブを高速遠心分離機に入れます。遠心分離によって形成されたペレットは通常目に見えません。マーキングは、遠心分離が行われ、チューブが遠心分離機から取り外されたときに、サッカリバクテリア細胞のペレットがどこにあるかを決定するのに役立ちます。
   2. サンプルを60,000 x g で4°Cで1時間遠心分離します。
      手記： この力と時間は、すべてのサッカリバクテリア細胞をペレット化するのに十分です。しかしながら、サッカリバクテリア細胞は、20,000 x g でわずか20分間遠心分離することにより、少なくとも部分的にペレット化することができます。
   3. 遠心分離機からチューブを慎重に取り外します。チューブから液体を注ぎ、ペレットをチューブの上側に保ちます。
   4. 通常は目に見えないペレットを、激しいボルテックスによって1〜2 mLのMRD(最大回収率希釈液)バッファーに再懸濁します。

2. 酵母菌が豊富な濾液で宿主培養物に感染する

1. 2 mLの適切な増殖培地(TSBY(0.1%酵母抽出物を含むトリプシン大豆ブロス)、BHI(Brain Heart Infusion)など)をチューブに等分して培養チューブを調製します。
2. 宿主生物の一晩培養物200 μLを各チューブに加えます。100〜200 μLの再懸濁し、ろ過したサンプルを各チューブに加えます。
3. 宿主生物に適した組み合わせたサンプルをインキュベートします(たとえば、37°C、 Arachnia propionicaの場合は好気性雰囲気中)。
4. 200 μLのバイナリ培養物を新しいチューブ内の2 mLの新鮮な増殖培地に移すことにより、2〜3日ごとに細胞を継代します。継代培養物が増殖を示さないように見える場合(つまり、新鮮な培地への継代後に培養物の濁度/光学密度が増加しない場合)、サッカリバクテリアはすべての宿主生物を圧倒するか、殺している可能性があります。これを改善するには、細胞を継代するときに200 μLの未感染宿主培養物を追加します。少なくとも5つのパッセージを繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブレインハートインフュージョンブロス(脱水粉末)	ベクトン・ディキンソン	211059	または標的生物に適した他の増殖培地
遠心分離機ローター 70-Ti	ベックマン・コールター	337922
2 コントロールInVitroグローブボックス	コイ・ラオラトリーズ	31615	微好気性生物に必要な場合
Optima L-100 XP 高速遠心分離機	ベックマン・コールター	8043-30-1124
P-1000マイクロピペット	ギルソン	F123601G
P-200マイクロピペット	ギルソン	F123602G
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	フィッシャーサイエンティフィック	BP399500
ペプトン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1420-500
ピペットチップ - 1000 μL	フィッシャーサイエンティフィック	02-717-166
ピペットチップ - 200 μL	フィッシャーサイエンティフィック	02-717-165
スクリューキャップ円錐遠心分離管 15 mL	隼	352096	または細菌培養に適した他のチューブ
厚肉ポリカーボネート 25 x 89 mm (容量 26.3 mL) キャップ付き遠心分離管	ベックマン・コールター	355618
トリプシン大豆血液寒天プレート	ノースイーストラボラトリーサービス	P1100	または宿主生物の増殖に十分な他の寒天プレート
トリプシン大豆ブロス(脱水粉末)	ベクトン・ディキンソン	211825	または標的生物に適した他の増殖培地
酵母エキス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1422-500