寒天培養からの亜硫酸塩還元嫌気性細菌の継代培養

要約

出典: Anwar、Z.、 et al.小売食品試料中の Clostridium perfringens 毒素型の濃縮と検出 J. Vis. 経験。(2019)。

このビデオでは、亜硫酸塩含有寒天培地で亜硫酸塩還元菌を培養し、嫌気性で増殖し、亜硫酸塩を硫化水素に還元し、鉄イオンを含む黒い沈殿物を形成します。黒いコロニーは、無菌技術を使用して寒天の深さから単離され、継続的な嫌気性インキュベーションのために新鮮な培地に移されます。

プロトコル

注:クロストリジウム・パーフリンゲンスは、バイオセーフティハザードレベル2(BSL2)の生物と見なされています。すべての食品サンプルにC.パーフリンゲンスが含まれているわけではありませんが、すべての培養サンプルはそのように扱われるべきです。すべての適切な予防措置と人員保護具 (PPE) を常に着用する必要があります。廃棄する前に、すべての材料を除染してください。

1. 修飾RPM(ラピッドパーフリンゲン培地)を調製する

1. 30 g/L 液体チオグリコール酸培地、60 g/L ゼラチン、5 g/L ペプトン、5 g/L グルコース、5 g/L リン酸二塩基性カリウム、3 g/L 酵母抽出物、1.5 g/L 塩化ナトリウム、0.5 g/L 硫酸第一鉄を脱イオン水に均一に分散するまで混ぜ合わせます。通常、1Lのバッチを製造します。
2. オートクレーブで121°Cで15分間。
3. 約40°Cまで冷却します。
4. RPMが冷めたら、D-シクロセリンを最終濃度440 mg / Lまで添加します。
   手記： 50 mg/mL の滅菌水に溶解した D-シクロセリンのストック濃度は、将来の使用のために -20 °C で保存できます。
5. 10 mLのRPMを15 mLのコニカルチューブに無菌的に移します。RPMはバッチで調製し、4°Cで最大1か月間保存できます。
6. 使用前にRPMを37°Cに温めてください。

2. サンプル採取とRPMインキュベーション

1. 周囲温度下で1時間以内に食品を実験室に輸送します。食品は、元のパッケージまたは滅菌容器に入れて輸送できます。すぐに検査しない場合、食品は使用するまで-20°Cで保管される場合があります。可能な場合は、包装ラベルに従って食品の種類と原産国、およびその他の関連情報をメモしてください。
2. 約1.0〜2.0 gの食品を取り出し、滅菌ペトリ皿または同等のものに移します。滅菌カミソリの刃またはメスで細かく刻みます。
3. 15 mLのコニカルチューブに10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を接種します。よく混ぜます。
   1. 栄養細胞を選択するには、5 mLのPBS-食品混合物を10 mLのRPMを含む15 mLの円錐形チューブに移します。ふたをしっかりと固定します。
   2. 胞子を選択するには、残りの5 mLのPBS-食品混合物を85°Cで15分間加熱し、10 mLのRPMを含む15 mLの円錐形チューブに移します。ふたをしっかりと固定します。
4. 食品RPM培養物をボルテックスして反転させ、完全な混合を確保します。
5. 嫌気性環境を確保するために、円錐形のチューブと蓋をパラフィンフィルムまたはラップでしっかりと密封します。
6. 37°Cで一晩(ON)インキュベートします。
7. 翌朝、RPMチューブ内の濁りや発酵に注意してください。

3. TSC(トリプトース亜硫酸シクロセリン)「サンドイッチ」めっき

1. 以下に説明する「サンドイッチ」技術を使用して、ON RPM培養物をTSC寒天に接種します(図1)。
2. 製造元の指示に従ってTSC寒天を準備します。
   1. 10 mLの溶融TSC寒天培地を滅菌ペトリ皿に移してTSCプレートのベース層を調製し、固化させます。これらは事前に準備し、4°Cで保存することができます。使用前にプレートが室温まで温められていることを確認してください。
   2. TSCプレートの最上層については、残りの溶融TSC寒天培地を40°Cに維持します。
      手記： 寒天の融点は85°C以上ですが、溶融寒天は32〜45°C付近で固化します。
3. ON RPM培養物を慎重に回収し、100 μLをTSC寒天ベースに移します。発酵のため、一部の文化は圧力にさらされている可能性があります。適切なすべてのPPEを着用してください。
4. 滅菌したガラスビーズまたはセルスプレッダーを使用してRPM接種物を広げます。
5. RPMを室温で5〜10分間TSC寒天に「吸収」させます。
6. 血清学的ピペットを使用して、20 mLの溶融40°C TSC寒天培地をプレートに慎重に移します。
7. ペトリ皿の蓋を元に戻し、TSC寒天を室温で完全に固化させます。
8. ペトリ皿を反転させ、37°Cでインキュベートします。
9. 連続希釈が必要な場合は、TSC寒天培地に接種する前に、ON RPM培養物を新鮮な予熱RPMに希釈します。

4.亜硫酸塩還元コロニーの継代培養

1. 翌朝、インキュベーターからプレートを取り出し、細菌の増殖を調べます。寒天の表面に好気性細菌が存在する場合があります。寒天内に埋め込まれた嫌気性細菌が増殖していることがわかります。亜硫酸塩還元菌は周囲の寒天を黒くします。考えられる C. パーフリンゲンス コロニーは黒く、寒天に埋め込まれます。
2. C. perfringens 疑われるコロニーは亜硫酸塩還元に対して陽性であり、寒天内に埋め込まれた黒く見えます。滅菌済みの使い捨てスポイトを使用して、寒天から黒いコロニーを「摘み取り」、15 mLのコニカルチューブ内の10 mLの新鮮なRPMに移します。寒天に穴を開ける前に、スポイトから空気を排出することが重要です。
3. プレートの表面に好気性細菌の増殖が密集している場合は、滅菌細胞スクレーパーを使用して、選択した領域からコロニーを除去します。複数の C.パーフリンゲンス疑いコロニーを同じTSCプレートから別々のRPM培養物にサンプリングできます。
4. 円錐形のチューブの蓋をしっかりと固定し、パラフィンフィルムまたはラップで包みます。ONを37°Cでインキュベートします。

結果

図1:TSC寒天サンドイッチ技術の概略図。

嫌気性環境を促進するために、 C. perfringens 細菌を含む RPM 培地は、TSC 寒天培地の 2 層の間にプレーティングされます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
D-シクロセリン	シグマ・アルドリッチ	C6880
葡萄糖	シグマライフサイエンス	D9434-250G
使い捨てトランスファーピペット	どのブランドでも		Thermo Scientific Disposable Transfer Pipet 137116M/EMDのようなスリムなチップのものを選択してください
DNeasy 血液および組織キット	キアゲン	69504	注:多数のDNAおよびプラスミド抽出キットが評価され、このキットは最も望ましい結果をもたらしました。
ドライインキュベーター	どのブランドでも
液体チオグリコール酸培地	レメル	R453452
ブタの皮からのゼラチン	シグマライフサイエンス	G1890-500G
硫酸鉄(II)七水和物	シグマライフサイエンス	F8633-250 G
鶏卵白からのリゾチーム	シグマ・アルドリッチ	L6876	DNA抽出に必要で、キットには含まれていません
パラフィルムまたはラップ	どのブランドでも
カゼインおよび他の動物性タンパク質からのペプトン	シグマ・アルドリッチ	70173-100G
パーフリンゲン寒天ベース(TSC + SFP)	オキソイド	CM0587	指示に従ってTSC寒天を作る
リン酸二塩基性カリウム	シグマ・アルドリッチ	P2222-100G
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S-7653
滅菌セルスクレーパー	どのブランドでも
滅菌セルスプレッダー	どのブランドでも
滅菌シャーレ	どのブランドでも
酵母エキス	シグマ・アルドリッチ	70161-100G