ストレス誘発細菌から単離した(p)ppGppヌクレオチドの薄層クロマトグラフィーに基づく分離

Abstract

出典:Fernández-Coll、L.およびCashel、M.大腸菌(p)ppGppの複数のin vivo測定にマイクロタイターディッシュ放射性標識を使用し、それに続く薄層クロマトグラフィー。J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオでは、薄層クロマトグラフィー(TLC)を使用して、細菌のストレス応答ヌクレオチドppGppおよびpppGppのレベルとダイナミクスを測定するためのハイスループットプロトコルを紹介します。この方法は、さまざまなストレス条件下で細菌培養中の (p)ppGpp を定量するための強力で迅速かつコスト効率の高いアプローチを提供し、細菌の生理学と厳密な応答の高分解能分析を可能にします。

Protocol

1. 薄層クロマトグラフィー
   1. 柔らかい鉛筆で、はさみで上部から5 cmを取り除いた20 cm x 20 cmのポリエチレンイミン-セルロース(PEI-セルロース)薄層クロマトグラフィー(TLC)プレートの端から1 cmの原点線に印を付けます。各サンプルのPEI表面に5 μLを液滴として塗布します。このスポットを乾燥させずに上昇開発を開始すると、縞模様が最小限に抑えられて解像度が向上します。
   2. 液体が原点サンプルスポットに触れないように十分に浅い1.5 M KH₂PO₄ (pH 3.4)溶液の層を含むタンクで上昇現像を行います。タンクを気密シールで覆い、トリミングされたシートの上部まで液体を15cm上昇させます。1.5 M KH₂PO 4溶液のpH_3.4 を達成するには、H₃PO₄を添加してpHを調整する必要があります。
   3. 完全に現像したクロマトグラムを取り出し、室温で自然乾燥させます。
   4. 遊離 ³²Pを含むクロマトグラムの上部(pHフロント)部分を切断し、放射性廃棄物に廃棄します。この部分は 図1 の黄色で表されており、UV光の下で簡単に視覚化できます。グアノシン三リン酸(GTP)よりも移動が遅い(p)ppGppヌクレオチドのみを測定する場合は、UV可視GTP標準物質を実行してから、より大きな上部( 図1に示すように、GTPを超えるもの)を切断して廃棄することをお勧めします。
   5. オートラジオグラフィーフィルムを蛍光体スクリーンで一晩露光します。
   6. フィルムを現像します。蛍光体スクリーン信号を蛍光体イメージャーで捕捉し、定量します。
       
2. (p)ppGppの定量
   1. 画像Jで放射性スポットを定量します。
      手記： (p)ppGppの量は、各サンプルで観察されたGヌクレオチドの総量に正規化できます(図1)。背景の量が均一な場合は、1つのブランク( 図1のボックス4)を差し引いて背景を補正できます。合計Gは、検出されたGTP + ppGpp + pppGppの合計です。この正規化は、グアノシン一リン酸 (GMP) とグアノシン二リン酸 (GDP) レベルが無視できることを前提としており、これは大 腸菌にも当てはまります。総Gに対する特定のヌクレオチドの比率は、適用されたサンプル量の変動を補正するための重要な方法を提供します。

Results

図1:代表的なTLC分析。 TLC によるオートラジオグラフィーと蛍光体スクリーニングを一晩行った後に得られた結果の概略図。測定するスポットは赤で示されています。ppGpp の分数量を計算する式も示されています。総Gとは、サンプル中で検出されたGTP+ppGpp+pppGppの総量を指します。黄色の帯は、紫外線下で見えるpHフロントを表しています。はさみは、放射能の大部分を廃棄するためにクロマトグラムを切断することを推奨する場所を示します。矢印は、1.5 Mリ...

Materials