巨大小胞内の細菌の単細胞培養

要約

出典: 森田正氏 他巨大小胞内の単細胞レベルでの細菌細胞培養 J. Vis. 経験。 (2019)。

このビデオは、支持された脂質二重層に固定された巨大な小胞内にカプセル化された個々の細菌細胞を培養および観察する方法を示しています。このシステムは、限られた生理学的に関連する微小環境における単一細胞増殖ダイナミクスの安定した長期イメージングを可能にします。

プロトコル

1. 巨大小胞(GV)観察システム(細菌細胞培養システム)の作製

1. 支持された二重層膜を構築するための小胞(SV)の調製
   1. 20 μLのPOPC(1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)溶液と4 μLのビオチン-PEG-DSPE(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチン(ポリエチレングリコール)-2000)溶液をガラス管に注ぎます。
   2. 有機溶媒を気流で蒸発させて脂質膜を形成し、このサンプルをデシケーターに1時間入れて有機溶媒を完全に蒸発させます。
   3. 200 μLの200 mMグルコースを1x LB(Luria-Bertaniブロス)培地(GVの外側の水溶液)にガラスバイアルに加えます。
   4. ガラスバイアルの開口部をフィルムで包み、超音波浴(120 W)で少なくとも1時間超音波処理します。
   5. ミニ押出機と孔径100nmのポリカーボネート膜を用いた押出法によりSVを作製します。
2. 手作りのチャンバーの準備
   1. 両面シール(10 mm x 10 mm x 1 mm)に中空パンチで7 mmの穴を開けます。
   2. 穴の開いた両面シールをカバーガラス(30 mm x 40 mm、厚さ0.25〜0.35 mm)に貼り付けます。
3. チャンバーの穴のカバーガラス上に支持された二重層膜の準備
   1. 30 μLのSV溶液をチャンバーの穴(セクション2.2で調製)に加え、RTで30分間インキュベートします。
   2. ピペッティングにより、200 mMグルコース(GVの外側の水溶液)を含む20 μLの1x LB培地で穴を2回穏やかに洗浄します。
4. チャンバーの穴のカバーガラス上の支持された二重層膜へのGVの固定化
   1. 10 μLのニュートラビジンをGVの外側の水溶液(1 mg / mL)とともに穴に導入し、RTで15分間インキュベートします。
   2. ピペッティングにより、200 mMグルコース(GVの外側の水溶液)を含む20 μLの1x LB培地で穴を2回穏やかに洗浄します。
   3. GVを含むすべての溶液をチャンバーの穴に加え、カバーガラス(18 mm x 18 mm、厚さ0.13〜0.17 mm)で密封します(図1b)。
5. GV内の細菌細胞増殖の顕微鏡観察
   1. 長い作動距離を持つ40倍/0.6倍の開口数(NA)対物レンズを備えた倒立顕微鏡で顕微鏡加熱ステージシステムをセットします(図1b)。
   2. チャンバーを顕微鏡加熱ステージシステムに置きます(図1b)。細菌細胞を含むGVをチャンバー内の静的条件下で37°Cで6時間インキュベートします。
   3. 科学的な相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)カメラを使用して、GV内の細菌細胞増殖の顕微鏡画像を30分ごとにキャプチャして記録します。

結果

図1:GV内の細菌細胞培養の観察システム。 (a)GVは、カバーガラス上のビオチン-ニュートラビジン結合を介して支持膜に固定化されます。GVは加熱システムによってインキュベートされます。(b) 手作りのチャンバーを含む観測システムの写真。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バクトトリプトン	BDバイオサイエンス	211705
クロロホルム	和光ピュアケミカルズ	032-21921
カバーガラス(18×18mm)	松波硝子工業	C018181	厚さ 0.13–0.17 mm
カバーガラス(30×40mm)	松波硝子工業	カスタムオーダー	厚さ 0.25–0.35 mm
卓上遠心分離機	ハイテク株式会社	ATT101	スイングロータータイプ
両面シール(10 × 10 × 1 mm)	ニトムズ	T4613
グルコース	和光ピュアケミカルズ	049-31165
倒立顕微鏡	オリンポス	IX-73
メタノール	和光ピュアケミカルズ	133-16771
微細加熱ステージシステム	東海ヒット	TP-110R-100
鉱油	ナカライテスク	23334-85
ニュートラビジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31000
対物レンズ	オリンポス	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
ポリカーボネート膜	アバンティ ポーラー リピッド	610005
sCMOSカメラ	アンドール	ザイラ 4.2 プラス	細孔径 100 nm
塩化ナトリウム	和光ピュアケミカルズ	191-01665
蔗糖	和光ピュアケミカルズ	196-00015
超音波浴	一つとして	ASU-3D
酵母エキス	BDバイオサイエンス	212750
0.6 mL蓋付きプラスチックチューブ	ワトソン	130-806C
1.5 mL蓋付きプラスチックチューブ	住友ベークライト株式会社	MS4265-M型
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン	アバンティ ポーラー リピッド	850457P
1,2-ジステアロイル-スングリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチン(ポリエチレングリコール)-2000]	アバンティ ポーラー リピッド	880129P	ポップ
			ビオチン-PEG-DSPE