エチレン放出化合物を用いたエチレンに対する細菌の反応の調査

要約

出典: Augimeri、RV ら、 細菌におけるエチレン応答を研究するためのツールとして、エチレン放出化合物である2-クロロエチルホスホン酸を利用しています。 J. Vis. 経験。 (2016年)

このビデオでは、2-クロロエチルホスホン酸(CEPA)によって生成されるエチレンが細菌の増殖とセルロース生成に及ぼす影響を示します。エチレンはセルロース合成を刺激するシグナル伝達経路を活性化し、その結果、ペリクル形成が促進されます。これらの結果は、エチレンに対する細菌の反応を浮き彫りにしています。

プロトコル

1. ペリクルアッセイ
   1. コマガタエイバクターキシリヌススターター培養物を3回増殖および定量化します。
      1. 3回に分けて、 コマガタエイバクターキシリヌスの 単一コロニーを、0.2%(v / v)フィルター滅菌セルラーゼを添加した5mlのシュラムおよびヘストリン(SH)培地(pH 5)に接種します。培養物を30°Cでインキュベートし、600 nm(OD₆₀₀)での光学密度が0.3〜0.4に達するまで150 rpmで攪拌します(約72時間)。
      2. 遠心分離(2,000 x g、4°C、10分)によってスターター培養物を収穫します。細胞を5mlの滅菌生理食塩水で2回洗浄し、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を氷の上に置いてください。
      3. Petroff-Hausser計数チャンバーを使用して細胞を定量します。
   2. 24ウェルプレートを接種するためのマスターミックスを準備します。
      1. 60 mlのSH培地(pH 7)に120 μlの5、50、および500 mMの2-クロロエチルホスホン酸(CEPA)ストックを補充して、それぞれ0.01、0.1、および1.0 mMの最終CEPA濃度を取得します。さらに60mlのSH培地(pH 7)に、CEPAの溶解に使用する溶媒120 μlを補充します。渦を混ぜる。
      2. CEPA含有培地60mlをそれぞれ14mlのアリコート4個に分けます。14mlのアリコートのうち3つに、10⁵ 細胞/ mlの濃度でスターター培養の生物学的複製を接種します。セルロースの生成を防ぐために、細胞の入ったチューブを氷の上に保管してください。
         手記： 残りの 14 ml アリコートは、無菌対照ウェルに使用されます。
   3. 24ウェルプレートを接種します。
      1. 各処理を、3列の生物学的複製と1列の無菌対照を使用して、独自のプレートでテストします(図1)。
      2. 14mlのマスターミックスを使用して、滅菌24ウェルプレートの6つのウェルのそれぞれに2mlを加えます。3回の生物学的複製と無菌対照が完了します(図1)。治療ごとに繰り返します。
      3. プレートをパラフィンフィルムで密封し、30°Cで7日間静的にインキュベートします。
      4. ペリクル乾燥重量(セルロース収量)の収穫と測定(図1):
         1. ペリクルを6ウェルプレートのウェルに個別に移します。細胞を溶解するには、ペリクルを12mlの0.1N水酸化ナトリウム(NaOH)で80°Cで20分間処理します。
         2. NaOHを除去し、超純水で24時間撹拌して洗浄してペリクルを中和します。6時間ごとに水を交換してください。
            手記： 洗浄ステップが完了すると、ペリクルは白くなるはずです。
         3. ペリクルウェイトをシリコンマットの上に置き、50°Cで48時間乾燥させ、一定の重量になります。乾燥したら、マットから取り出し、分析スケールで重量を測定して、細菌セルロースの収量を決定します。

結果

図1:ペリクルアッセイと分析に使用されるプロトコルを示すフローチャート。CEPAを添加したストックpH 7 SH培地(60 ml)を、3つの別々の生物学的複製接種と無菌対照(各14 ml)のために分注します。次に、これらの培養物を 6 回のテクニカル レプリケーション (2 ml) に分注して 24 ウェル プレートにし、パラフィン フィルムで密封します。30°Cで7日間インキュベートした後、ペリクルを採取し、FT-IRによって湿潤重量、厚さ、乾燥重量、結晶化度を測定することによって特徴付けます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Trichoderma reesei ATCC 26921由来のセルラーゼ	シグマ	C2730	水溶液
クエン酸	バイオショップ	CIT002.500	SH培地用
エテフォン(≥96%;2-クロロエチルホスホン酸)	シグマ	C0143	エチレン放出化合物
グルコース	バイオベーシック	GB0219	SH培地用
駒形エイバクター・キシリヌス ATCC 53582	ATCCの	53582	細菌性セルロース産生アルファプロテオバクテリウム
リン酸ナトリウム、二塩基性七水和物	バイオショップ	SPD579.500	リン酸ナトリウム、SH培地用二塩基性七水和物
NaCl	バイオベーシック	SOD001.1	生理食塩水および対照溶液用の塩化ナトリウム
リン酸ナトリウム、一塩基性一水和物	バイオショップ	SPM306.500	リン酸ナトリウム、対照溶液用の一塩基性一水和物
ナオウ	バイオショップ	SHY700.500	pH調整用水酸化ナトリウム
パラフィンフィルム	パラフィルム	PM996	シールプレートおよびフラスコ用
ペプトン(細菌学的)	バイオショップ	PEP403.1	SH培地用
ペトロフ・ハウスサー計数室	Hausser scientific	3900	細菌細胞計数チャンバー
ポリエーテルスルホン滅菌フィルター 0.2 μm	VWRの	28145-501	セルラーゼの滅菌用
酵母エキス	バイオベーシック	G0961	SH培地用