細菌宿主における自殺プラスミドの増幅

要約

出典:Tomás、 JM、 et al。細菌の運動性における細菌グリコシルトランスフェラーゼの役割を解明するためのヌル変異体の生成 J. Vis. 経験。(2022)。

このビデオは、 大腸菌 における自殺プラスミドのイニシエーター依存性増幅を示しています。抗生物質耐性遺伝子を保有するプラスミドは、宿主によってコードされるイニシエータータンパク質の存在下でのみ複製されます。エレクトロポレーションおよび回収培地でのインキュベーションの後、混合物を抗生物質含有寒天培地にプレーティングします。プラスミドを持つ細菌は、その開始タンパク質がプラスミドの抗生物質耐性遺伝子の発現を可能にするため、生き残ります。

プロトコル

1. べん毛グリコシル化島遺伝子におけるヌル変異体の生成

注:この変異誘発方法は、自殺ベクターpDM428(GenBank:KC795686.1)を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)フレーム内欠失産物の対立遺伝子交換に基づいています。pDM4ベクターの複製はラムダ pir 依存性であり、ベクター上にある sacB 遺伝子を利用して完全な対立遺伝子交換が強制されます。

1. PCRインフレーム欠失産物の構築
   1. 削除する選択した遺伝子または領域の上流(AおよびBプライマー)および下流(CおよびDプライマー)のDNA領域を増幅する2組のプライマーを設計します(図1B)。
   2. プライマーAとDが、削除する遺伝子の開始から上流と停止から下流にそれぞれ600 bp以上あることを確認してください。これら2つのプライマーは、pDM4でのクローニングを可能にするエンドヌクレアーゼの5'末端に制限部位を含める必要があります。
      注:AおよびDプライマーの5'末端に含まれる制限部位は、ABまたはCDアンプリコン内の部位と同じであってはなりません。
   3. プライマーBとCが、削除する遺伝子内にあるか、削除する領域の最初と最後の遺伝子内にあることを確認してください。両方のプライマー(BとC)がフレーム内にあり、遺伝子内の5〜6個のコドンの間にあることを確認してください。さらに、両方のプライマーが5'末端に、DNAアンプリコンABとCDの結合を可能にする21 bpの相補配列(表1)が含まれていることを確認してください。
   4. 選択した エアロモナス 株を5 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)で30°Cで一晩(O / N)増殖させます。ゲノムDNA精製には市販のキットを使用し、製造元の指示( 材料表)に従ってください。分光光度計を使用して精製した DNA 2 μL を定量します。
      注:二重蒸留水をブランクとして使用し、260 nmで吸光度を記録するように装置を設定します。2 μLの精製DNAで吸光度を3〜5回記録し、平均吸光度測定値を計算します。ビール・ランバートの法則を使用してDNA濃度を計算し、A = Ɛ.c.l.ここで、「A」は吸光度、「Ɛ」はDNAのモル平均吸光係数、「c」はDNA濃度、「l」は経路長です(各機器の経路長については、製造元の説明書を参照してください)。
   5. 100 ngの精製した染色体DNAをテンプレートとして、A-BおよびC-Dプライマーを含む2セットの不斉PCRを使用します(材料表)。A:BおよびD:Cプライマーペアのモル比を10:1にします。
      注:不斉PCRでは、テンプレートの一方の鎖を他方の鎖よりも優先的に増幅できます。
   6. 1%アガロースゲル中の電気泳動によりPCR産物を分析します。TAE(40 mM Tris-acetate、1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA))をゲルランニングバッファーとして使用し、電力設定を 8 V/cm にします。DNAを可視化するには、臭化エチジウム(0.5 μg/mL)をゲルに添加し、バイオイメージングステーションを使用してPCR産物を可視化します(材料表)。
   7. メスを使用してゲルからアンプリコンを切除し、製造元のプロトコル(材料表)に従って精製し、定量します。
   8. PCR産物の3'末端の21 bpの重複配列によってABおよびCDアンプリコンを結合します(図2)。各アンプリコン(ABおよびCD)をPCRチューブに100 ngをPCR試薬(プレAD PCR)と混合し、プライマーは使用せず、サーモサイクラープログラムを使用して伸長します。次に、100 μMのAおよびDプライマーを反応(AD PCR)に加え、単一のフラグメントとして増幅します。
   9. 手順1.1.6で説明した条件を使用して、1%アガロースゲル中で電気泳動によりPCR産物(ADアンプリコン)を分析し、ゲルからアンプリコンを切除し、製造元のプロトコルに従って精製し、アンプリコンを定量します(材料表)。
2. フレーム内欠失によるpDM4組換プラスミドの構築
   1. pDM4を含む大腸菌cc18λpirのO/N培養物を、クロラムフェニコール(25μg/mL)とともにルリアベルタニ(LB)ミラーブロス(10 mL)で30°Cで増殖させます。
   2. 培養物を4°Cで5,000 x g でスピンダウンし、ペレットを600 μLの滅菌蒸留水に懸濁します。プロバイダの指示に従って、市販のプラスミド精製キットを使用してプラスミドpDM4の抽出および精製を実行します( 材料表)。
   3. ADアンプリコンの両端とpDM4のクローニング部位を消化できるエンドヌクレアーゼを使用して、1 μgのpDM4と400 ngのADアンプリコンを2時間消化します(図2)。反応条件については酵素メーカーのプロトコルに従ってください( 材料表)。
   4. 消化したプラスミドとアンプリコンをDNA精製キットを使用してクリーンアップし、製造元の指示に従って定量します( 材料表)。
   5. 直鎖化したpDM4のライゲーションを防ぐために、製造元の指示に従ってアルカリホスファターゼ酵素を使用して両端の5'からリン酸基を除去します( 材料表)。次に、処理したプラスミドをクリーンアップし、ステップ1.1.4( 材料表)に記載されているように分光光度計を使用して定量します。
   6. 150 ngの消化およびホスファターゼアルカリ処理されたpDM4と95〜100 ngの消化されたADアンプリコンをモルベクター:インサート比1:4で組み合わせます。製造元の指示(材料表)に従って、15 μLの容量でライゲーション反応を調製します。
   7. O/Nを20°Cで、または週末に4°Cでインキュベートします。インキュベーション後、T4リガーゼを70°Cで20分間不活性化します。
   8. ライゲーションを使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌MC1061λpir株にプラスミドを導入します。電気的バクテリアと2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットを使用します。
3. エレクトロコンピテント大 腸菌 の調製とpDM4組換えプラスミドのエレクトロポレーション
   1. 大腸菌MC1061λpir株の単一コロニーをLuria-Bertani(LB)ミラーブロスに接種し、200 rpm振とうしながら30°CでO/Nを増殖させます。
   2. 2 mLの細菌培養物を18 mLのLBブロスで希釈し、0.4〜0.6の光学密度(OD600)に達するまで振とう(200 rpm)しながら30°Cでインキュベートします。
   3. 細菌培養物を5,000 x g および4°Cで15分間遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、ペレットを40 mLの冷却蒸留H₂Oに懸濁します。
   4. この洗浄ステップをさらに2回繰り返して、すべての培養塩を除去します。最後に、ペレットを4 mLの冷却蒸留H₂Oに懸濁し、1 mLの懸濁液を4本の円錐形の1.5 mLマイクロフュージチューブのそれぞれに移します。
   5. 細菌培養物を14,000 x g 、4°Cで5分間遠心分離してペレット化します。ペレットを乱すことなく上清を除去し、各ペレットを100 μLの冷却蒸留H₂Oに懸濁します。
   6. 3〜3.5 μLのライゲーション混合物を各チューブに加え、氷上で5分間インキュベートします。次に、各チューブの内容物を冷却した2 mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移し、2 kV、129 Ω、および約5 msの時定数を適用します。
      注:エレクトロポレーションキュベットを氷上で予冷します。手順全体を通してバクテリアを氷上に維持します。
   7. エレクトロポレーション後、250 μLのSOC(異化物抑制を伴うスーパーオプティマルブロス)培地を4つのキュベットのそれぞれに加えて内容物を回収し、培養チューブ(約1 mL)に移し、振とう(200 rpm)しながら30°Cで1時間インキュベートします。
   8. 形質転換した細胞をクロラムフェニコール(25 μg/mL)を添加したLuria-Bertani(LB)寒天プレートにプレートし、プレート上で増殖するすべてのコロニーがプラスミド骨格を持ちていることを確認します。

表1:ヌル変異体の構築に使用されるプライマー。プライマーBとCの重複する領域には下線が引かれています。BamHIサイトは、プライマーAとDで太字で表示されています。

プライマー名	5'から3'方向のシーケンス	用途
A.ピシコラ AH-3
A-Flgi1	CGCGGATCCGACTGTTACCCGTTTCAATCA	FGI ミュータント
B-Flgi1	CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCacctcgaactcgaaa
C-Flgi12	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12	CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1	ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-FLGI12	TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-FGI4	CGCガトッコ ガトッコガトクグタアタアトガア	FGI-4変異体
B-FGI4	CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT
C-FGI4	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-FGI4	CGCGGATCCアカタットCAACCCCCAAC
E-FGI4	ATTTCCCTGCCAAATACG
F-FGI4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4ベクター
pDM4の場合	AGTGATCTTCCGTCACAGG	pDM4ベクターへの挿入
pDM4rev	AAGGTTTAACGG TTGTGGA

結果

図1:染色体領域のバイオインフォマティクス検出とプライマー設計。 (A)A.hydrophilaAH-1およびA.piscicolaAH-3で同定された染色体領域のスキーム。A. hydrophila AH-1べん毛グリコシル化島は、べん毛糖鎖がシューダミン酸誘導体のみを持つ株の代表であり、A. piscicola AH-3べん毛グリコシル化島は、べん毛糖鎖がヘテロ多糖類である株の代表です。黒で示された遺伝子はプシュダミン酸の生合成に関与しており、黄色で示された遺伝子は推定GT...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 サイクルシーケンシング対応反応キット	アプライドバイオシステムズ	4337455	シーケンスに使用
AccuPrime Taq DNAポリメラーゼ、高忠実度	インビトロゲン	12346-086	AB、CD、ADフラグメントの増幅に使用
アガロース	コンダプロナダイス	8008	DNA電気泳動に使用
アルカリホスファターゼ、ふくらはぎ腸(CIAP)	プロメガ	M1821	5'末端のリン酸塩を除去するために使用されます
バクト寒天	ベクトン・ディキンソン	214010	運動性解析に使用
バムハイ	プロメガ	R6021	エンドヌクレアーゼ制限に使用
BGLII	プロメガ	R6081	エンドヌクレアーゼ制限に使用
BioDoc-It イマジンシステム	UVP (紫外線)		DNA可視化に用いるバイオイメージングステーション
Biotaqポリメラーゼ	バイオライン	バイオ-21040	コロニースクリーニングに使用
Cytiva illustra GFX PCR DNA およびゲルバンド精製キット	シティビア	28-9034-71	PCRアンプリコンやDNA断片の精製に用いられます。
EDTAの	応用	131026.1211	DNA電気泳動に使用
エレクトロポレーションキュベット 2 mm ギャップ	VWRの	732-1133	変換に使用
Luria-Bertani (LB) ミラー寒天	コンダラボ	996	大 腸菌 培養に使用
ルリア・ベルターニ(LB)ミラーブロス	コンダラボ	1551	大 腸菌 培養に使用
ナノドロップ ND-1000	NanoDrop テクノロジー株式会社		DNA定量に使用される分光光度計
リファンピシン	応用	A2220,0005	三親交配に使用
SOCミディアム	インビトロゲン	15544034	エレクトロポレーション回収に使用
T4 DNAリガーゼ	インビトロゲン	15224017	ライゲーション反応に使用
Veriti 96ウェルサーマルサイクラー	アプライドバイオシステムズ		PCR反応に使用