ゲノムトランスポゾン挿入によるグラム陰性菌の単離

要約

出典: Kazi、MI、 他、 ハイスループットシーケンシングのためのグラム陰性菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成。 J.ビス。 (2020年)

このビデオは、カナマイシン耐性に基づいてトランスポゾン挿入を運ぶグラム陰性レシピエント細菌の選択、定量化、および保存を示しています。

プロトコル

最終的な細菌変異体ライブラリーの生成

1. 氷上で凍結交尾のアリコートを解凍します。
2. ステップ3.1で計算されたコロニー形成単位(CFU)に基づいてカナマイシンを添加した150 mmのLuria-Bertani(LB)寒天プレートでのプレートの交配。プレーティング前にLBで容量を調整して、150 μLあたり13,333コロニーを生成します。
   手記： ここでのCFU数は約10⁵ CFU / mLと決定されたため、交配量を調整して、プレートあたり13,333コロニーを取得しました。これにより、プレートを過密にすることなく、高解像度の変異体ライブラリーのために、30枚のプレート上に最適な数のコロニーが提供されます。
3. 滅菌ガラスビーズを使用して、プレートあたり150 μLの希釈液をカナマイシンを添加した30 x 150 mmのLuria-Bertani寒天プレートに広げ、400,000コロニーを取得します(図1C)。
   手記： 滅菌ロッドまたはあらゆる種類の滅菌スプレッダーツール(すなわち、ガラスビーズ)を使用して、プレート上に細菌を広げることができます。
4. 余分な嵌合を含む使用済みチューブは廃棄してください。
   手記： 凍結/融解サイクルは細菌培養物に選択圧を加え、Tn-seq実験結果を歪める可能性があります。毎回新鮮なアリコートを使用してください。
5. プレートを37°Cで14時間インキュベートします。
   手記： インキュベーション時間は、過増殖(コロニーが接触する)を防ぐために最適化されています。インキュベーション時間を短縮して成長を最小限に抑えることが提案されています。

ライブラリー密度の推定とストレージのプーリング

1. 各プレート上のCFUをカウントして、トランスポゾンライブラリ内の総変異体を推定します。少なくとも3つのプレートの20%をカウントして、プレートのグループ全体のコロニー数の推定値を決定します(図2A)。コロニーが別のコロニーに触れていないことを確認します。
2. 推定コロニー収量を計算した後、各プレートに3〜5 mL(または必要に応じてそれ以上)を加え、滅菌スクレイピングツールを使用して細菌をこすり落とします。手記： プレートを効率的に削るために、滅菌接種ループが使用されました。
3. すべてのプレートからの細菌懸濁液を50 mLの円錐形チューブにプールします(図1D)。これには、複数の 50 mL コニカル チューブ (少なくとも 3 本) が必要になります。
4. ペレットプールされた細菌懸濁液を、5,000 x g で7分間遠心分離して使用します。
5. 上清を廃棄し、ペレットを30%グリセロールを添加した5 mLのLBに再懸濁します。
6. トランスポゾンライブラリー1 mLをクライオバイアルにアリコートし、-80°Cで保存します。

結果

図1:トランスポゾン変異体ライブラリ構築の概略図。 (A)細菌の抱合。転位機構をコードする「ドナー」株は、「レシピエント」株と混合されました。混合物をLuria-Bertani(LB)寒天プレート上で発見し、1時間交配させました。(B)トランスポゾンライブラリの生成。転位機構を運ぶプラスミドを「ドナー」株から「レシピエント」株に移し、トランスポゾンを「レシピエント」株のゲノム全体にランダムに挿入しました。(C)選択。得られた細胞をカナマイシンを添加した寒天プレートにプレーティングし、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
150mm x 15mm ペトリ皿	コーニング	351058
50mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管	フィッシャーサイエンティフィック	12-565-271
アシネトバクター・バウマンニ ATCC 17978	ATCCの	該当なし	アンプ、カンザス州
大腸菌 MFDダップ-	該当なし	該当なし	DAPの栄養素性は、成長するために600 mMの外因性添加DAPを必要とします。プラスミド導入用のRP4機構が含まれています。JNW68(36)用キャリア。
外ネジ式極低温バイアル	コーニング	09-761-71
ガラスビーズ	コーニング	72684
グリセロール	フィッシャーサイエンティフィック	G33
ループの接種	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-602	スクレイピングツール
カナマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP906	25 mg/Lで使用
LB寒天、ミラー	フィッシャーサイエンティフィック	BP1425
LBブロス、ミラー	フィッシャーサイエンティフィック	BP1426
リン酸緩衝生理食塩水、10X 溶液	フィッシャーサイエンティフィック	BP39920	1倍に希釈