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1. 自然な変化
手記： N315誘導体であるN2-2.1をレシピエントとして使用しました。この株では、 SigH 遺伝子座が複製され、SigHが構成的に発現しました。転写する耐性マーカーがクロラムフェニコールでない場合は、pRIT-sigH(CmR)を使用してSigHを発現できます。 cfr獲得の 黄色ブドウ球菌 COL-45から精製されたプラスミドまたは全DNA抽出物は、形質転換のためのドナーDNAとして使用されます。
- ドナーDNAの調製
- 32 mg/Lクロラムフェニコールを添加した50 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)を含む300 mlフラスコで、37°Cで振とうしながらCOL-45を一晩培養します。pHY300プラスミド(TetR)を保有する大腸菌HST04を培養し、対照実験用のプラスミドを抽出します。
手記： HST04(dam-/dcm-)にはDNAメチラーゼ遺伝子が欠けています。DNAメチル化状態は形質転換効率に影響を与えないため、DNAメチラーゼを含む他の従来の株もDNAドナーの調製に使用できます。あるいは、 黄色ブドウ球菌 COL株から精製されたpT181プラスミドも、形質転換アッセイのポジティブコントロールとして使用できます。 - 遠心分離(4°Cで10分間、8,000 x g )によって細胞を収集します。
- プラスミドDNA抽出キットまたは従来のDNA精製法を使用してプラスミドを抽出し、DNA全体を精製します。
- 精製したDNAを分光計で定量し、使用するまで4°Cに保ちます。
手記： 形質転換アッセイには、通常1週間未満の新鮮なDNA調製物を使用します。古いDNA調製物は形質転換の効率を低下させます。
- 変換アッセイ
- レシピエント細胞(N2-2.1)を37°Cの5mlのTSBで一晩培養し、振とうします。
- 0.5mlの一晩培養液を1.5mlチューブに移します。遠心分離(4°Cで1分間、10,000 x g )によって細胞を沈殿させます。
- 50 mlチューブに10 mLのCS2培地で細胞を懸濁します。
手記： CS2培地は、 黄色ブドウ球菌の自然形質転換能力を誘導する完全な合成培地です。TSBや脳心臓注入(BHI)などの他の標準的な実験用培地は、形質転換には適していません。 - 37°Cで後期指数期(約8時間)まで振とう(180 rpm)しながら細菌を増殖させます。
- 遠心分離(4°Cで5分間、5,000 x g )によって細胞を回収します。
- 細胞を10mlの新鮮なCS2培地に再懸濁します。
- 10 μgの精製プラスミドまたはゲノムDNA(ステップ1.1.4)を細胞懸濁液に加えます。37°C、180rpmで2.5時間振とうします。
手記： DNAとのインキュベーション時間が短い(<2.5時間)と、形質転換頻度が低くなります。 - 遠心分離(4°Cで5分間、5,000 x g )によって細胞を収集します。
- 細胞を10 mLのBHI培地に再懸濁します。細胞懸濁液を90mlの溶融BHI寒天培地(55°C)サプリメントと32 mg/Lクロラムフェニコール(または対照実験では5 mg/Lテトラサイクリン)と混合します。混合物を90mmのペトリ皿に注ぎます。素早く冷やして寒天を固めます。
- プレートを37°Cで2日間インキュベートします。
- 生成されたコロニー(形質転換体)を適切な抗生物質を含む新しいBHI寒天プレートに(つまようじを使用して)移し、耐性特性を確認することにより、生成されたコロニー(形質転換体)を複製します。コロニーPCRにより獲得耐性遺伝子(cfr または tetM)を確認します。