C.エレガンスノックダウンをスクリーニングするためのマルチウェル液体ベースのアッセイ

要約

出典: アンダーソン、Q.L. 他。 ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、 Caenorhabditis elegans を使用して、宿主と病原体の相互作用中の遺伝子ノックダウンを研究するハイスループットスクリーニング方法を示します。ノックダウンワームを調製し、アッセイプレートに移して、病原体誘発性ワーム殺滅の効果を評価する手順を概説します。

プロトコル

1. 複数の Caenorhabditis elegans 株またはノックダウンのスクリーニングのための適応 (リボ核酸干渉 (RNAi) スクリーニングのセットアップ)

手記： これは、24ウェルプレートセットアップ用に記述されたRNAiスクリーニングです。

1. RNAiを播種したワームを含む24ウェルプレートのウェルあたり1 mLのS Basalを追加します。プレートを振ってワームを穏やかに撹拌し、ワームを空の滅菌24ディープウェルプレートに移します。ワームが重力によって落ち着くのを待ちます(~5分)。
2. 上清を吸引し、約1mLを残します。各ウェルに7 mLのS基礎を加えます。
3. 手順1.1〜1.2を少なくとも2回繰り返します。最終洗浄後、上清を吸引し、約400 μLを残します。
4. ワームソーターのリサンプラー機能を使用して、24ウェルプレートワーム懸濁液から22本のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別します(24ウェルプレートの各ウェルは、384ウェルプレートの8〜12ウェルを生成します)。
   1. 飢餓を避けるために、選別する前に細菌を384ウェルプレート(OP50などの食物としてのみ機能する菌株、または病原性菌株)にピペットで入れます。
5. ワームを384ウェルプレートに選別した後、小分子またはその他の実験固有の材料を追加します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
COPAS FP バイオソーター	ユニオンバイオメトリカ		大型物体フローサイトメーター/ウォームソーター
24 ディープウェルRBブロック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CS15124
384ウェルプレート	グライナーバイオワン	MPG-781091
線虫増殖培地(NGM)			リットルあたりの量:寒天18グラム、NaCl3グラム、ペプトン2.5グラム、塩化カルシウム(1 M)1 mL、硫酸マグネシウム(1 M)1 mL、リン酸緩衝液25 mL、およびミリQ水973 mL
S基礎			リットルあたりの量: NaCl 5.85 グラム、リン酸一塩基性カリウム 6 グラム、リン酸二塩基性カリウム 1 グラム、およびミリ Q 水 1 リットル
寒天	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
ペプトン	USBiological Life Sciences	P3300
塩化カルシウム	USBiological Life Sciences
硫酸マグネシウム	フィッシャーサイエンティフィック	M63-500
リン酸緩衝液			リットルあたりの量:リン酸二塩基性カリウム(1M)132mL、リン酸一塩基性カリウム(1M)868mL
リン酸一塩基性カリウム	アクロスオーガニック	7778-77-0
リン酸二塩基性カリウム	USBiological Life Sciences	P5100
細菌株
緑膿菌 (PA14)
大腸菌スーパーフード(OP50)
大腸菌RNAi発現菌(HT115)
ワーム株
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)