C.エレガンス幼虫における病原菌誘発性死亡率の評価

要約

出典: アンダーソン、Q.L.、 他。ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオは、遺伝子組み換えされた C.エレガンスの 幼虫をマイクロプレート内の病原菌にさらす液体ベースのアッセイを示しています。培地に分泌された細菌毒素は、宿主のストレスと死を誘発します。蛍光色素は死んだワームを染色し、画像ベースの死亡率の定量化を可能にし、遺伝的感受性または耐性を評価します。

プロトコル

1. リキッドキリングアッセイのセットアップ(基本プロトコル)

手記： これは、1つの細菌株と1つのワーム源のプロトコルです。

1. 細胞スクレーパーを使用して、Slow KillingまたはSKプレートから 緑膿 菌を取り出し、~5 mLのS基礎に再懸濁します。必要に応じてスケールアップします。分光光度計(OD₆₀₀)を使用して細菌懸濁液の光学密度を測定します。
2. 緑 膿菌 の希釈ストック24 mLをOD₆₀₀ ≈ 0.09(最終濃度3倍)のSベースで調製します。ウェルあたりの最終含有量については 4.6.2 を参照し、それに応じて細菌希釈量をスケールします。
3. 21 mLの液体スローキル培地(3 gのNaCl、3.5 gのペプトン/ LにCaCl₂ およびMgSO₄ を添加して、最終濃度1 mM)を加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、45 μLの細菌と培地を384ウェルプレートの各ウェルに移します。
4. ワームを発生源から50 mLの円錐形チューブに洗浄し、重力でワームを沈降させます。上清を5mLまで吸引します。合計50 mLのS基礎に再懸濁します。
5. 手順1.4を2回繰り返します。
6. ワーム選別機を使用して、約22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別します。
   手記： セットアップでは、各ワームを~1.1 μLの液体に落とします。22匹のワームは25 μLになり、総アッセイ量は70 μL/ウェルになります。
   1. 各ウェルの最終組成は70 μLで構成されています。この容量の45 μLを細菌培地として添加します(0.03 OD 24 μL S Basalに₆₀₀ 個の細菌、およびCaCl₂ およびMgSO₄を添加した21 μL SK)。残りの25 μLに22個のワームを加えます。
   2. ここで使用する選別機( 材料表を参照)が利用できない場合は、ワームをS基礎で1ワーム/μLの最終濃度に希釈し、マルチチャンネルピペットを使用して25μL/ウェルでピペッティングすることができます。ただし、結果のばらつきが大きくなる場合があります。あるいは、Leungらが説明したように、蠕動液体ディスペンサーを使用することも可能です。
7. ワームを384ウェルプレートに選別した後、プレートをガス透過性フィルムで密封し、プレートを25°Cで24〜48時間インキュベートします。
8. お好みの時間に、マイクロプレート洗浄機を使用して、384ウェルプレートをS Basalで合計5回洗浄します。
   1. 2回目の洗浄後、ほとんどの培地を吸引し、~20 μLを残します。マイクロプレートボルテクサーを使用してプレートを少なくとも30秒間激しく振って、ウェルの底から破片を緩めます)。
9. 最終洗浄後、上清を20 μLまで吸引します。50 μLの0.98 μM核酸染色( 材料表を参照)/384ウェルプレートのウェルを加え、最終濃度を0.7 μMにします。
10. 室温で12〜16時間インキュベートします。この染料は死んだワームを汚すだけです。所望のインキュベーション期間の後、マイクロプレート洗浄機を使用してプレートを洗浄し、余分な汚れを取り除きます(最低3回洗浄)。
11. データ取得には、分光光度計または自動顕微鏡を使用して、透過光と蛍光の両方を画像化します(励起531 nm、発光593 nm)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
COPAS FP バイオソーター	ユニオンバイオメトリカ		大型物体フローサイトメーター/ウォームソーター
細胞化5	バイオテック
EL406 ウォッシャーディスペンサー	バイオテック
マルチトロンプロ	インフォーサー HT
24 ディープウェルRBブロック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CS15124
384ウェルプレート	グライナーバイオワン	MPG-781091
線虫増殖培地(NGM)			リットルあたりの量:寒天18グラム、NaCl3グラム、ペプトン2.5グラム、CaCl₂(1 M)1 mL、MgSO₄(1 M)1 mL、リン酸緩衝液25 mL、およびミリQ水973 mL
スローキリング(SK)プレート			リットルあたりの量:寒天18グラム、NaCl3グラム、ペプトン3.5グラム、CaCl₂(1 M)1 mL、MgSO₄(1 M)1 mL、リン酸緩衝液25 mL、および973 mLのミリQ水
スローキリング(SK)メディア			リットルあたりの量:3グラムのNaCl、3.5グラムのペプトン、1 mLのCaCl₂(1 M)、1 mLのMgSO₄(1 M)、25 mLのリン酸緩衝液、および973 mLのミリQ水
溶原性ブロス(LB)	USBiological Life Sciences	L1520
ブライアンハートインフュージョンブロス(BHI)	リサーチプロダクツインターナショナル株式会社	50-488-526
ワーム漂白剤溶液			100 mLあたりの量:5 M NaOH溶液10 mL、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液20 mL、滅菌水70 mL
S基礎			リットルあたりの量: NaCl 5.85 グラム、KH₂PO₄ 6 グラム、K₂HPO₄ 1 グラム、および 1 リットルのミリ Q 水
寒天	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
ペプトン	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl₂	USBiological Life Sciences
MgSO₄	フィッシャーサイエンティフィック	M63-500
リン酸緩衝液			1リットルあたりの量:132mLのK₂HPO₄(1M)と868mLのKH₂PO₄(1M)
KH₂PO₄	アクロスオーガニック	7778-77-0
K₂HPO₄	USBiological Life Sciences	P5100
5%次亜塩素酸ナトリウム溶液	ビッカ	7495.5-32
NaOH溶液	フィッシャーサイエンティフィック	SS255-1
息がしやすい	多様なバイオテクノロジー	ベム-1
SYTOXオレンジ核酸染色	フィッシャーサイエンティフィック	S11368
細菌株
緑膿菌 (PA14)
E.フェカリス (OG1RF)
大腸菌 スーパーフード(OP50)
大腸菌 RNAi発現菌(HT115)
ワーム株
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFPレポーター(Kang et al., 2018, PMID: 29532717)