C.エレガンス幼虫における病原菌誘発性死亡率の評価

要約

出典: アンダーソン、Q.L.、 他。ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオは、遺伝子組み換えされた C.エレガンスの 幼虫をマイクロプレート内の病原菌にさらす液体ベースのアッセイを示しています。培地に分泌された細菌毒素は、宿主のストレスと死を誘発します。蛍光色素は死んだワームを染色し、画像ベースの死亡率の定量化を可能にし、遺伝的感受性または耐性を評価します。

プロトコル

1. リキッドキリングアッセイのセットアップ(基本プロトコル)

手記： これは、1つの細菌株と1つのワーム源のプロトコルです。

1. 細胞スクレーパーを使用して、Slow KillingまたはSKプレートから 緑膿 菌を取り出し、~5 mLのS基礎に再懸濁します。必要に応じてスケールアップします。分光光度計(OD₆₀₀)を使用して細菌懸濁液の光学密度を測定します。
2. 緑 膿菌 の希釈ストック24 mLをOD₆₀₀ ≈ 0.09(最終濃度3倍)のSベースで調製します。ウェルあたりの最終含有量については 4.6.2 を参照し、それに応じて細菌希釈量をスケールします。
3. 21 mLの液体スローキル培地(3 gのNaCl、3.5 gのペプトン/ LにCaCl₂ およびMgSO₄ を添加して、最終濃度1 mM)を加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、45 μLの細菌と培地を384ウェルプレートの各ウェルに移します。
4. ワームを発生源から50 mLの円錐形チューブに洗浄し、重力でワームを沈降させます。上清を5mLまで吸引します。合計50 mLのS基礎に再懸濁します。
5. 手順1.4を2回繰り返します。
6. ワーム選別機を使用して、約22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別します。
   手記： セットアップでは、各ワームを~1.1 μLの液体に落とします。22匹のワームは25 μLになり、総アッセイ量は70 μL/ウェルになります。
   1. 各ウェルの最終組成は70 μLで構成されています。この容量の45 μLを細菌培地として添加します(0.03 OD 24 μL S Basalに₆₀₀ 個の細菌、およびCaCl₂ およびMgSO₄を添加した21 μL SK)。残りの25 μLに22個のワームを加えます。
   2. ここで使用する選別機( 材料表を参照)が利用できない場合は、ワームをS基礎で1ワーム/μLの最終濃度に希釈し、マルチチャンネルピペットを使用して25μL/ウェルでピペッティングすることができます。ただし、結果のばらつきが大きくなる場合があります。あるいは、Leungらが説明したように、蠕動液体ディスペンサーを使用することも可能です。
7. ワームを384ウェルプレートに選別した後、プレートをガス透過性フィルムで密封し、プレートを25°Cで24〜48時間インキュベートします。
8. お好みの時間に、マイクロプレート洗浄機を使用して、384ウェルプレートをS Basalで合計5回洗浄します。
   1. 2回目の洗浄後、ほとんどの培地を吸引し、~20 μLを残します。マイクロプレートボルテクサーを使用してプレートを少なくとも30秒間激しく振って、ウェルの底から破片を緩めます)。
9. 最終洗浄後、上清を20 μLまで吸引します。50 μLの0.98 μM核酸染色( 材料表を参照)/384ウェルプレートのウェルを加え、最終濃度を0.7 μMにします。
10. 室温で12〜16時間インキュベートします。この染料は死んだワームを汚すだけです。所望のインキュベーション期間の後、マイクロプレート洗浄機を使用してプレートを洗浄し、余分な汚れを取り除きます(最低3回洗浄)。
11. データ取得には、分光光度計または自動顕微鏡を使用して、透過光と蛍光の両方を画像化します(励起531 nm、発光593 nm)。

材料