RNAi発現菌の培養と維持

要約

出典: Anderson、Q.L.、 et al.、 ハイスループット、ハイコンテント、液体ベースの C.エレガンス 病原システム。 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、標的遺伝子発現を阻害するためにプラスミドを運ぶRNA干渉(RNAi)細菌の調製を示します。下流アッセイ用のdsRNA発現プレートを製造するためのRNAi細菌の選択、増殖、および誘導ステップの概要を説明します。

プロトコル

1. RNA干渉(RNAi)細菌の調製

1. RNAi含有細菌の目的の株を、適切な抗生物質(AhringerおよびVidalライブラリーの場合は100 μg/mLのカルベニシリンと15 μg/mLのテトラサイクリン)を含む溶原性ブロス(LB)寒天プレートにストリークアウトまたはピン転写します。
   手記： 非病原性細菌を扱う場合は、バイオセーフティレベル(BSL)-2 A/B生物学的安全キャビネットまたはBSL-1層流フードのいずれかを使用して、培養物の無菌性を確保し、ライブラリーの相互汚染の可能性を最小限に抑えます。
2. プレートを37°Cで24時間インキュベートします。
3. プレートを4°Cで最大2週間保存します。
   1. 2週間後、プレートを廃棄し、作りたてのプレートと交換します。
4. 各クローンの1つのコロニーを、24ウェルディープウェルプレートのシングルウェルまたは滅菌試験管内のカルベニシリンを添加したLB4 mLに個別に接種することにより、複数のRNAi株を並行してテストします。 
   手記： テトラサイクリンはRNAiの効率を低下させることが報告されています。この媒体では使用しないでください。
5. 24ウェルディープウェルプレートをマルチウェルプレートに最適化された振とうインキュベーターに入れ、950 rpmで振とうしながら37°Cで16時間インキュベートします。 手記： 従来の振とうインキュベーターを使用してマルチウェルプレートで均一な細菌増殖を得ることは困難です。振とうインキュベーターは、培養物が適切に増殖するために、最低750rpmで振とうできる必要があります。専用のシェーカーがない場合、個々のチューブで各培養物を増殖させることが可能です。培養物は、その後遠心分離のために24ウェルプレートに移すことができます。
6. 2,000 x g で 5 分間遠心分離して細菌を収集します。
7. プレートを反転させ、激しく振って上清をデカントします。RNAi細菌を100 μLのS基礎(5.85 gの塩化ナトリウム、NaCl、1 gリン酸二カリウム、K₂HPO₄、6 gリン酸一カリウム、KH₂PO₄ を1 Lの超純水に溶解し、オートクレーブで滅菌)に再懸濁します。
8. マルチウェルNGMプレート(線虫増殖培地、3 g NaCl、2.5 gペプトン、1 mM塩化カルシウム、CaCl₂、1 mM硫酸マグネシウム、MgSO₄、25 mLのリン酸緩衝液(1リットルあたりの量:132 mLのK₂HPO₄ (1 M)および868 mLのKH₂PO₄ (1M))、および水1リットルあたり寒天18g)にIPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド、最終濃度1 mM)およびカルベニシリン(最終濃度100 μg/mL)を添加した。
   1. 6ウェルプレートのウェルあたり3.5 mL、24ウェルプレートのウェルあたり1 mL、または96ウェルプレートのウェルあたり150 μLのNGM培地を使用します。
   2. 6ウェルプレートには100 μL/ウェル、24ウェルプレートには50 μL/ウェル、96ウェルプレートには20 μL/ウェルの細菌を使用します。乾燥させます。
      手記： 乾燥は通常、迅速かつ均一な乾燥を促進するために、無菌フローフードで行われます。均一な乾燥は非常に重要です。寒天のひび割れはワームの穴掘りを促進するため、過度の乾燥は避けてください。これにより、ウォームの損失が発生し、液体処理システムの目詰まりが発生する可能性があります。
9. 準備したプレートをすぐに使用するか、後で使用するために4°Cで最大2週間保存してください。
   手記： プレートの乾燥を防ぐために、プラスチックパラフィンフィルムで密封するか、湿らせたペーパータオルを入れた密閉容器に入れることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ディープウェルRBブロック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CS15124
線虫増殖培地(NGM)			リットルあたりの量:寒天18グラム、塩化ナトリウム3グラム、ペプトン2.5グラム、塩化カルシウム(1 M)1 mL、硫酸マグネシウム(1 M)1 mL、リン酸緩衝液25 mL、およびミリQ水973 mL
溶原性ブロス(LB)	USBiological Life Sciences	L1520
S基礎			リットルあたりの量: 塩化ナトリウム 5.85 グラム、リン酸一カリウム 6 グラム、リン酸二カリウム 1 グラム、ミリ Q 水 1 リットル
寒天	USBiological Life Sciences	A0930
塩化ナトリウム	USBiological Life Sciences	S5000
ペプトン	USBiological Life Sciences	P3300
塩化カルシウム	USBiological Life Sciences
硫酸マグネシウム	フィッシャーサイエンティフィック	M63-500
リン酸緩衝液			リットルあたりの量:リン酸二カリウム(1M)132 mLおよびリン酸一カリウム(1 M)868 mL
リン酸一カリウム	アクロスオーガニック	7778-77-0
リン酸二カリウム	USBiological Life Sciences	P5100