海洋生物発光細菌における発光オペロンの発現

要約

出典: Brodl、E.、 et al。その 場で 生物発光細菌の細胞密度と発光の測定と相関 J. Vis. 経験。 1 (2018年)

このビデオでは、海洋生物発光細菌の培養をデモンストレーションして、クオラムセンシングを介した発光オペロンの活性化を観察し、微生物のコミュニケーションと遺伝子制御の研究のための遺伝子発現と発光のリアルタイムモニタリングを可能にします。

プロトコル

1. 細菌生物発光株の発現

手記： 細菌の生物発光株は、成長と光生産のために特定の増殖培地/人工海水培地を必要とします。

1. 別々に調製された2つの培地成分で構成される人工海水培地を調製します。
   手記： 以下の量は、1 Lの液体培地または1 Lの寒天培地に対してです。
   1. 人工海水培地の場合、次の塩で計量します:28.13 g NaCl(塩化ナトリウム)、0.77 g KCl(塩化カリウム)、1.60 g CaCl₂ ・2H₂O(塩化カルシウム二水和物)、4.80 g MgCl₂ ・6H₂O(塩化マグネシウム六水和物)、0.11 g NaHCO₃ (重炭酸ナトリウム)、および3.50 g MgSO₄ ・7H₂O(硫酸マグネシウム七水和物)。
   2. 蒸留水1Lを加え、すべての成分を溶かします。
   3. LB (Luria-Bertani) 培地の場合は、酵母抽出物 10 g、ペプトン 10 g、寒天プレートの場合は寒天培地 20 g を追加で計量します。
   4. 水道水250mLを加え、成分を溶かします。
   5. 調製した両方の培地を別々に121°Cで20分間オートクレーブします。
   6. 寒天プレートの場合は、オートクレーブ滅菌直後に250 mLのLB培地と750 mLの人工海水培地を混合し、プレートを調製します。
   7. 液体培地の場合は、オートクレーブ滅菌直後または冷却時に、250 mLのLB培地と750 mLの人工海水培地を混合します。
      手記： 人工海水媒体は、塩分の沈殿によって濁ることがあります。
2. 細菌の生物発光株を人工海水培地寒天プレートにストリークし、24〜30°Cで一晩インキュベートします。
   手記： 細菌株の長期保存は、通常、細菌培養物のグリセロールストックを凍結することによって達成されます。解凍後の成長に遅れがあるため、液体培養に使用する前に、すべての株の均一な開始条件を確保するために、株は常に最初に寒天プレートに縞模様を描く必要があります。
3. 100 mLの人工海水培地にプレートからの単一のコロニーを接種することにより、ONC(オーバーナイト培養)を調製します。ONCを24〜30°Cおよび120rpmでインキュベーターシェーカーで一晩インキュベートします。
4. 800 mLの人工海水培地に8 mLのONCを接種します。
5. インキュベーターシェーカーで細菌細胞を24〜30°Cおよび120rpmでインキュベートします。
   手記： 生物発光細菌の光強度プロファイルは、温度によって大きく変化します。それぞれの細菌株の光産生の調節メカニズムに応じて、発光は約1〜6時間後に開始されることがあります。
6. 細菌細胞培養が輝き始めるまで観察します(約1〜6時間)。
   手記： 発現の目的によって、翌日まで細胞を成長させてから採取したり、細胞が輝いている限り揺れ続けることもできる。細胞の採取とタンパク質の精製は、標準的な手順に従って行うことができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Multitron 標準インキュベーターシェーカー	インフォーズAG