マイクロ流体チャンバーを用いたストレス下での細菌増殖の顕微鏡解析

要約

出典: Cayron、J.、 et al。 ストレス処理下での細菌増殖のマルチスケール解析 J. Vis. 経験。 (2019)。

このビデオでは、ストレス条件下で細菌細胞をイメージングするためのマイクロ流体プレートを準備して使用する方法を示します。細菌培養とストレス誘発抗生物質培地を導入し、その後に細胞ローディングと顕微鏡セットアップを行うプロセスの概要を説明します。次に、位相差モードでのタイムラプスイメージングを使用して、細胞分裂の阻害によりDNA含有量が増加した細長い糸状細胞の発達を観察します。

プロトコル

1. マイクロ流体タイムラプス顕微鏡イメージング
   1. マイクロ流体プレートから保存溶液を取り出し、マイクロ流体ソフトウェアユーザーガイドの説明に従って、37°Cに予熱した新鮮な培地と交換します。
   2. マイクロ流体プレートをマニホールドシステムに密閉し、プライミングボタンをクリックします。
   3. 顕微鏡取得を開始する前に、マニホールドシステムを備えたマイクロ流体プレートを顕微鏡ステージに置き、37°Cで~2時間予熱します。
      手記： この予熱ステップは、タイムラプス実験中に顕微鏡の焦点が変化し、画像取得が損なわれるマイクロ流体チャンバーの膨張を回避するために重要です。
   4. マイクロ流体プレートを密閉します。ウェル8の培地を150 μLの培養サンプルに交換し、ウェル1から5までの培地をストレス誘発試薬の有無にかかわらず目的の培地に交換します。
   5. マイクロ流体プレートを密封し、顕微鏡ステージに置きます。
   6. マイクロ流体ソフトウェアで、セルローディング手順を実行します。透過光で顕微鏡下で観察して、セルの負荷が満足のいくものであることを確認します。チャンバー内のセル密度が不十分な場合は、セルローディング手順をもう一度実行します。
   7. 透過光モードで注意深く焦点を合わせ、孤立した細菌を示すいくつかの視野を選択します。単離された細胞の増殖を経時的に監視できるように、過密ではない圃場を選択することが重要です(100μm²あたり~10〜20個の細胞が推奨されます)。これにより、画像解析中の細胞検出も容易になります。
   8. マイクロ流体ソフトウェアで、[プロトコルの作成]ボタンをクリックします。細胞が適応できるように、増殖培地の注入を1〜2世代時間相当でプログラムします(オプション)。次に、ストレス誘発培地の注入を2 psiで10分間プログラムし、続いてストレス処理の必要な期間、1 psiで注入します。ストレス後の細胞の回復を分析する場合は、必要な期間、新鮮な増殖培地の注入をプログラムします。
      手記： ここで紹介する実験では、セファレキシンを2 psiで10分間注射し、続いて1 psiで50分間注射しました。次に、新鮮な増殖培地を2 psiで10分間注入し、続いて1 psiで3時間注入しました。
   9. 透過光の位相差と、必要に応じてmCherry信号の560 nm励起光源を使用して、10分ごとに1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを実行します。
      手記： マイクロ流体注入プロトコルの開始と同時に顕微鏡画像取得を開始することが重要です。

材料