勾配阻害剤プレートを使用した細菌の群れの評価

要約

出典: Guo、S.、 et al。誘導勾配板上の細菌表面群がる運動性の定量化 J. Vis. 経験。(2022)。

このビデオでは、二層勾配スウォームプレートを使用して、さまざまな阻害剤濃度下での細菌の群れ行動を研究する方法を示します。最下層に勾配形成阻害剤を配置したプレートに細菌を接種し、インキュベートします。細菌の群れに対する阻害剤濃度の影響を分析するために、定期的に画像が撮影されます。

プロトコル

1. 勾配スウォームプレートの準備

1. 群れ培地の調製
   注:このプロトコルでは、群培地の0.7%(w / v)寒天濃度を使用しました。
   1. 2つの円錐形のフラスコに寒天を含む溶原性ブロス(LB)粉末を調製します。各フラスコには、2 gのトリプトン、2 gの塩化ナトリウム(NaCl)、1 gの酵母抽出物、および1.4 gの寒天が含まれています。二重蒸留水(ddH₂O)を加え、磁気撹拌バーを使用して懸濁液を撹拌します。追加のddH₂Oを追加して、最終容量を200 mLに調整します。
   2. 溶液を121°Cで20分間オートクレーブします。通気性のあるキャップまたは通気孔付きのボトルシールフィルムを使用してください。
      注:寒天はオートクレーブで加熱すると溶解します。
   3. 温度が65°Cに下がったら、溶液を混合して均一性を確保し、培地を65°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに移して短期間使用します。
2. 最下層の群れ培地の調製
   注:最下層培地は、スウォーム培地と誘導剤原液の混合物です。誘導剤勾配群板の定式化を 表1に示します。
   1. 凍結乾燥レスベラトロール粉末114.12 mgをジメチルスルホキシド(DMSO)5 mLに溶解して100 mMレスベラトロール原液を調製し、溶液を-20°Cで保存します。
   2. 6 gのアラビノース粉末を30 mLのddH₂Oに溶解することにより、20%(w / v)アラビノース原液を調製します。アラビノースが溶解するまで10〜15分間待ちます。溶液を室温で保存します。
   3. 65°Cのインキュベーターから培地を取り出し、室温に置きます。三角フラスコが保持できるほど冷えるまで(~50°C)、スウォーム培地を冷まします。寒天が固まる原因となるため、スウォーム培地を室温に長時間置かないでください。
   4. 必要な量の誘導剤原液を50°Cのスウォーム培地に加えます(表1)。誘導剤溶液を注ぐのではなく、ピペットを使用して分注します。ゆっくりと旋回させて、誘導剤をスウォーム培地と混合します。
      注:このステップは、オートクレーブ滅菌できない誘導剤用です。媒体に気泡が入らないように注意してください。
3. 二層勾配群板の調製
   注:上層培地は、0.7%(w / v)寒天を含むLB培地です。
   1. 13 x 13 cmの正方形のペトリ皿に誘導剤名と菌株をラベル付けし、皿を蓋の端に支えます(図1B)。
   2. 50 mLピペットまたは50 mL遠心分離管を使用して、40 mLの温かい最下層培地(50°C)を加えます。
      注:あるいは、13 x 13 cm正方形のペトリ皿には、40 mLの最下層および上層培地が適しています。10 x 10 cmの正方形のペトリ皿には、25 mLの最下層と上層培地が適しています。
   3. 最下層の培地を層流フード内で覆わずに1時間硬化させます。培地が固まる間、四角いペトリ皿を邪魔しないでください。
      注:最下層を硬化させている間、誘導剤を含まないスウォーム培地は、65°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに維持する必要があります。
   4. 最下層が完全に固まったら、蓋を外し、四角いペトリ皿を層流フードの中に入れます。
   5. 50 mLピペットまたは50 mL遠心分離管を使用して、40 mLの温かい上層培地(50°C)を追加します。
      注:上層培地には誘導剤は含まれていません。
   6. ベンチトップの二重層プレートを1時間硬化させ、覆って邪魔されずに硬化させます。調製したプレートを4°Cで最大24時間保存します。注:硬化時間が長いと、水分含有量が減少し、群がる運動性が制限されます。

2. 大腸菌K12と緑膿菌PAO1の増殖

1. 5 gのトリプトン、5 gのNaCl、および2.5 gの酵母抽出物をddH₂Oに加えて、500 mLのLB培地を調製し、溶液を500 mLまで補充します。溶液を液体サイクルで121°Cで20分間オートクレーブし、4°Cで保存します。
2. 1 gのトリプトン、1 gのNaCl、0.5 gの酵母抽出物、および1.5 gの寒天培地をddH₂Oに加え、100 mLの1.5%(w / v)LB-寒天培地を調製し、溶液を100 mLまで補充します。溶液を121°Cで20分間液体サイクルでオートクレーブします。寒天が固まるのを防ぐために、培地を50°Cのウォーターバスに移します。
3. LB寒天培地フラスコが持ちやすい場合は、25 mLピペットを使用して20 mLのLB寒天培地をペトリ皿(直径10 cm)に加えます。プレートを室温で一晩放置し、LB-寒天プレートを4°Cで保存します。
4. -80°Cで保存したストック培養物、縞模様のストック培養物 大 腸菌 K12、大 腸菌 K12-YdeH、 緑膿菌 PAO1、および緑 膿菌 PAO1-YdeH株を使い捨て接種ループを使用してLB-寒天ペトリ皿に取ります。37°Cで一晩逆さまにしたペトリ皿をインキュベートします。
5. ペトリ皿から異なる株の単一コロニーを選択し、各コロニーを5 mLのLB培地に接種し、220 rpmに設定された実験室のオービタルシェーカーで37°Cで培養物をインキュベートします。
6. 培養密度がOD600nm~1.0に達したら、シェーカーから培養物を取り出し、室温に置きます。手順3.2.1で説明するように、培養密度をOD600nm = 1.0に調整します。

3. 勾配群板の接種とインキュベーション

1. 接種ウェルの準備
   注:標準距離で分離された井戸を生成できる3Dプリントカバーモデルは、以下に説明する方法の代わりに使用できます。
   1. 図1Cに示すように、A4用紙にウェルの位置をマークします。1つの正方形のペトリ皿に3つの試験濃度を2つまたは3回の繰り返しで設定します。
   2. マークを付けたA4用紙を固めたグラデーションプレートの下に置きます。100 μLピペットチップの広い側を、マークされた位置の半固体培地表面に押し込みます。ピペットチップが上層培地の底に達するまで押します。
   3. 先端が底に触れたときは、先端に垂直方向の力を加えないでください。先端をゆっくりと回転させて、円筒形のウェルの内容物を分離します。
   4. ピペットチップを非常に短い距離に沿って水平に動かして、取っておいた狭いスペースに空気が流れるようにします。親指と中指でピペットを持ちながら、人差し指でチップを押してチップ内のガスの流れを遮断します。
   5. チップを垂直に引き出し、引き抜きながらチップにウェルの内容物を保ちます。
      注:ウェルの内容物が滑った場合は、人差し指で少し圧力をかけてチップを完全に密閉します。
   6. マークされたすべての位置で手順3.1.2から3.1.5を繰り返します。接種前に群盤プレートを覆います。
2. グラジエントプレートの接種とインキュベーション
   1. 一晩の増殖培養密度をOD600nm = 1.0に調整します。
   2. 80 μLのオーバーナイト増殖培養物をすべてのウェルにピペットで入れます。細菌培養物を井戸の外にこぼさないでください。
   3. プレートをシールフィルムで包みます。長期観察(3〜5日)の場合は、プレートを滅菌実験用ゴムテープで包みます。
      注:ゴムテープは壊れにくいです。
   4. ddH₂Oで満たされたビーカーをインキュベーターに入れて、インキュベーター内の湿度を維持します。グラジエントスウォームプレートを37°Cでインキュベートします。
      注:スウォームプレートを逆さまにインキュベートしないでください。これにより、細菌培養物が井戸から漏れます。
   5. 接種直後の群れプレートを画像化し、これを0時間の時点として記録します。

4. 細菌表面の群れのイメージング

1. スウォームプレートを12時間ごとにインキュベーターから一度に1つずつ取り出し、プレートを水平に保持し、ゲルイメージングシステムに入れます( 材料表を参照)。
   注:プレートの表面に指紋を残さないでください。清潔な手袋でスウォームプレートの側面を持ちます。
2. ゲルイメージングモードを選択します。スウォームプレートを白色光にさらします。焦点距離を調整して、群れを最も鮮明に見ることができます。
   注:特定のバッチ内のすべてのプレートに同じ焦点距離を使用します。
3. 露光時間を300msに調整することで、群れの明るさを高めて鮮明に観察します。スレッショルドを調整して、背景光からの干渉を最小限に抑えます。
   注:しきい値は、ゲルイメージングシステムの操作インターフェースで調整されます。左側の値を大きくすると、背景光からの干渉が最小限に抑えられます。右側の値を小さくして、群れの明るさを高めます。このプロトコルでは、通常、地域は 6,000 から 50,000 の間です。
4. さらに分析するために、画像ファイルを保存します。イメージング時間、インデューサーの種類、勾配方向、ひずみを .txt ファイルに記録します。

 

表1:二層スウォーム培地の仕様。

上層培地/溶原性ブロス培地(100 mLあたり)
トリプトン:1 g
塩化ナトリウム:1g
酵母エキス:0.5g
寒天:0.7 g
最下層培地/誘導剤含有培地(100mLあたり)
トリプトン:1 g	作業集中:	原液濃度:
塩化ナトリウム:1g
酵母エキス:0.5g	- レスベラトロール:400μM	- レスベラトロール: 100 mM
寒天:0.7 g
インデューサ：	- アラビノース: 0.5% (w/v)	- アラビノース: 20% (w/v)
- レスベラトロール原液:400μL	または1%(w / v)
- アラビノース原液:2.5mLまたは5mL

結果

図1:インデューサー勾配スウォームプレートの調製、接種、およびインキュベーションの概略図。 (A)37°Cでの細菌培養の一晩増殖。(B)二層誘導勾配スウォームプレートのワークフロー。i)正方形のシャーレを支えます。ii)最下層培地を注ぎ、室温で固化させる。iii)正方形のペトリ皿を平らに置き、上層培地を注ぎます。iv)プレート硬化。v)マークされた位置に対応する井戸を作ります。vi)細菌培養物をウェルにピペットで入れます。vii) シールフィルムまたはゴムテープを使用してプレー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	シグマ・アルドリッチ	V900500	500グラム
アンピシリン	ソーラービオ	A8180	25 g、≥ 85% (GC)
遠心分離管	コーニング	430790	15ミリリットル
極低温バイアル	コーニング	430488	2ミリリットル
ジメチルスルホキシド(DMSO)	アラジン	D103272	AR、> 99% (GC)
L(+)-アラビノース	アラジン	A106195	98%(GC)、500g
ペトリ皿	ブクマン	B-SLPYM90-15	プラスチック製ペトリ皿、円形、90 mm x 15 mm
レスベラトロール	アラジン	R107315	99%(GC)、25 g
塩化ナトリウム	マックリン	S805275	AR、99.5%(GC)、500 g
四角いペトリ皿	ブクマン	B-SLPYM130F	プラスチック製ペトリ皿、正方形、13 mm x 13 mm
トリプトン	サーモサイエンティフィックオキソイド	LP0042	500グラム
酵母エキス	サーモサイエンティフィックオキソイド	LP0021	500グラム
機器
生化学インキュベーター	ブルーパード	LRH-70
Tanon 5200マルチイメージングシステム	タノン	西暦5200年
サーモスタットウォーターバス	ジンホン	DK-S28