組換えタンパク質の生産と細菌由来小胞からの回収

要約

出典: Streather、BR、 et al。 大腸菌からの組換蛋白質充填小胞の最適化された生産と分析 J. Vis. 経験。 (2023年)

このビデオでは、小胞核ペプチド(VNp)でタグ付けされた組換えタンパク質を細菌小胞から産生および単離する方法を示します。インデューサーはVNpタグ付きタンパク質の発現を誘発し、小胞の形成とカプセル化を促進し、続いて遠心分離と超音波処理を行い、細胞溶解を行わずに効率的なタンパク質回収を実現します

プロトコル

1. 細菌細胞培養とタンパク質誘導

1. T7プロモーターから組換えタンパク質発現を誘導するには、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最大20 μg/mL(84 μM)の最終濃度まで添加します。組換えタンパク質発現の誘導は、小胞の産生のために後期対数期(すなわち、典型的な光学密度、OD₆₀₀ 0.8-1.0)で発生する必要があります。​
   手記： 誘導期間の長さはタンパク質によって異なる場合があり、4時間で最大生産に達するものもあれば、一晩(18時間)に達するものもあります。今日まで、オーバーナイト培養で最大の小胞輸出が得られています。

2. 組換え小胞の単離

1. 3,000 x g (4°C)で20分間遠心分離して細胞をペレット化します。
2. 長期保存のために小胞含有培地を滅菌するには、透明化された培地を滅菌および界面活性剤を含まない0.45 μmポリエーテルスルホン(PES)フィルターに通します。
   手記： 小胞含有濾液からの生細胞の除外をテストするには、溶原性ブロス(LB)寒天培地にプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
3. 小胞をより小さな体積に濃縮するには、滅菌小胞含有培地を滅菌および界面活性剤を含まない0.1 μm混合セルロースエステル(MCE)フィルターに通します。
4. 細胞スクレーパーまたはプラスチックスプレッダーを使用して、0.5〜1 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でメンブレンを穏やかに洗浄し、メンブレンから小胞を慎重に取り除きます。新しいマイクロフュージチューブに移します。​
   手記： 精製された小胞は、4°Cの滅菌培地またはPBSに保存できます。このようにして、酵素活性を損なうことなく、これらの小胞に6か月間保存された組換えタンパク質の例があります。

3. 単離された小胞からの可溶性タンパク質の放出

1. タンパク質含有小胞を滅菌培地/緩衝液に単離したら、装置の適切なスケジュール(例えば、6x 20秒のオンおよびオフサイクル)を使用して小胞脂質膜を超音波処理し、39,000 x g (4°C)で20分間遠心分離して小胞の破片を除去する。 手記： 浸透圧ショックまたは界面活性剤処理は、小胞を壊すための代替手段として使用できますが、タンパク質の機能および/または下流の適用への影響を考慮する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)	メルフォード	367-93-1
溶原性ブロス(LB)/ LB寒天	ラボストック	NA	10 g / Lトリプトン;10 g / L NaCl;5 g/L 酵母エキス (1.5 g/L寒天)
MF-ミリポアメンブレンフィルター(0.1μm、MCE)	メルク	VCWP04700
Millipore Express PLUSメンブレンフィルター(0.45 μm、PES)	メルク	HPWP04700
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ラボストック	NA