大腸菌におけるFプラスミド転移と二重抗生物質選択

要約

出典: Erdogan、F.、et al.、 細菌の接合に関与するトランスファータンパク質の配列特異的分析のための共役交配アッセイ。 J. Vis. 経験。 (2017年)

このビデオでは、レスキュープラスミドを使用してドナーからレシピエント大 腸菌 細胞にFプラスミドを移し、二重抗生物質耐性を介してトランスコンジュガントを選択する手順を示します。このプロセスには、細菌培養の混合、振とうことなくインキュベーション、交配ペアの破壊、プラスミド転移の成功を確認するための選択培地へのプレーティングが含まれます。

プロトコル

1. XK1200ドナーからMC4100レシピエントへの共役交配アッセイ

1. 20 μg/mLクロラムフェニコール(Cm)、50 μg/mLカナマイシン(Km)およびMC4100細胞を50 μg/mLストレプトマイシン(Sm)を含む20 mLの滅菌溶原性ブロス(LB)でXK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184遺伝子細胞のO/N培養物を寒天プレート上のグリセロールストックまたはシングルコロニーと滅菌ピペットまたはループで調製します。培養物を37°Cで200rpm振とうして増殖させます。
2. 各O/N培養物から1:70の希釈液を、同じ抗生物質を含む2 mLの滅菌LBに別々に作ります。すべてのドナー細胞に最終濃度100 mMのグルコースを加えます。細胞を37°Cで200 rpmで振とうしながら対数期(OD₆₀₀ 0.5-0.7)まで増殖させます。
3. 遠心分離(4,000 x g、4°Cで5分間)して細胞をペレット化し、上清を廃棄し、コールド滅菌LBで1回洗浄して抗生物質を除去し、細胞を2 mLのコールドステイルLBに再懸濁します。
4. 2 回に分けて、各培養物 100 μL を 800 μL の滅菌 LB 培地に分注し、振とうことなく 37 °C で 1 時間交配させます。
5. 細胞を30秒間渦巻きして交尾ペアを破壊し、それ以上の交尾を防ぐために氷の上に10分間置きます。
6. ボルテックス混合物と新鮮な滅菌LBを使用して、トランスコンジュガントの6希釈液(^10-2 〜^10-7)を調製します。 図1のように、50 μg/mL Smおよび20 μg/mL Cmを含む寒天プレートの各半分に各希釈液の10 μLアリコートをスポットすることにより、トランスコンジュガントMC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm細胞を選択します。両方の重複した混合物について繰り返します。その領域を無菌状態に保ち、炎の近くで作業してください。プレートO/Nを37°Cでインキュベートします。

結果

図1:結合における標的遺伝子の機能を評価するための交配アッセイ。 ドナー細胞とレシピエント細胞は、それぞれpK184-TraFとMC4100で形質転換された大腸菌XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cmでした。得られたトランスコンジュガント(MC4100 pOX38-Tc ΔtraF::Cm)は、SmおよびCmを含むプレート上で増殖し、共役機能の回復に成功したことを示しています。実験は単一の寒...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875713
抗生物質			最終濃度
クロラムフェニコール(cm)	フィッシャーサイエンティフィック	BP904-100	20 μg/mL
カナマイシン (km)	株式会社バイオベーシック	DB0286	50 μg/mL
ストレプトマイシン(Sm)	フィッシャーサイエンティフィック	BP910-50	50 μg/mL