光活性化フラビンモノヌクレオチドを用いた細菌の不活化

要約

出典: Cheng、C.、 et al.リボフラビン‐5′‐りん酸の可視光光分解による病原体の不活性化 J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオでは、病原菌に対するフラビンモノヌクレオチド(FMN)の光毒性効果を評価する方法を示します。細菌培養物は、濃度の増加したFMNにさらされ、可視光で照らされて、細胞成分に損傷を与える活性酸素種(ROS)を生成します。次に、生き残った細菌を定量化して、生存率の用量依存的な低下を評価します。

プロトコル

1. FMN光分解後の黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)の生存率(図1)
   1. のコロニー 黄色ブドウ球菌 (BCRC 10451) 培養プレートから、15 mLのスクリューキャップ付き試験管で採取した10 mLの溶原性ブロスに移します。37°Cのシェーカーで16時間培養します。
   2. 0.5 mLの培養物を1.5 mLの遠心分離管に移します。滅菌水を遠心分離管に加え、培養物を600 nm(OD₆₀₀)で0.5の光学密度に希釈します(~6 x 10⁷ コロニー形成単位[CFU]/mL)。
   3. 培養物0.5 mLを1.5 mL遠心チューブに移し、14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントして細胞ペレットを取得します。
   4. 1 mLのリボフラビン-5'-リン酸(またはフラビンモノヌクレオチド;FMN)緩衝液(リン酸カリウム緩衝液[PB]中の30、60、および120μM FMN)をステップ 1.3のように得られた細胞ペレットに、ボルテックスします。照射対照の場合は、PBを単独で1mL添加します。
   5. 30 μM FMNおよびPBのみを含む生菌細胞溶液をそれぞれ1 mLずつガラス管に移し、10 W / m² の紫色光を30分間照射します。
   6. 30、60、および120 μM FMNおよびPBのみを含む生菌細胞溶液をそれぞれ1 mLをガラス管に移し、20 W /^{m 2} の青色光を120分間照射します。120 μM FMNを含む1 mLの生菌細胞溶液で別のガラス管をセットアップし、20 W /^{m 2} で60分間青色光を照射します。
   7. 手順 1.5 と 1.6 の説明に従って試験管をセットし、厚いアルミホイルで覆います。これらのチューブはダークコントロールとして機能します。
   8. 照射チャンバー(および暗いコントロール)は、30〜120分間の照射期間中、9±〜1°Cの冷蔵室に保管します。
      手記： 発光ダイオード (LED) ライトから放出される熱は、カップ内に配置された LED チップが照射実験中に光反応システムを加熱する可能性があるため、無視することはできません。したがって、実験は9±1°Cに保たれた冷蔵室で実施されました。
   9. 照射後、各反応溶液から0.2 mLをルリア寒天培地(LA)プレートに移します。L字型のガラス棒でプレート上に細菌を広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
   10. 一晩増殖した後の 黄色ブドウ球菌 の生存プレート数と不活性化率を計算します。

手記：黄色ブドウ球菌の不活性化率は、減少率として計算され、[1 -I / D] ×100%に等しく、ここでIとDはそれぞれ、照射されたサンプルとダークコントロール中のCFUの数を示します。減少率は、不活性化率の負の値として定義されます。

結果

図1:黄色ブドウ球菌の生存率 に対するFMN光分解の影響。減少率は、(A)FMNを20 W/^m2で20 W/m2で120分間照射し、(B)紫色光を10 W/^m2で30分間照射したFMNで処理した黄色ブドウ球菌の不活化率の負値として定義されています。FMN濃度と照射時間は図の上部に示され...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
青、緑、赤のLEDライト	Vita LED Technologies Co.、台南、台湾		直流12V 5050
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	190186
赤外線温度計	Raytek Co. カリフォルニア州サンタクルーズ	MT4の
LBブロス	ニュージャージー州ディフコ株式会社
L-メチオニン	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	1.05707
NBTの	Bio Basic, Inc. マーカム、オンタリオ州、カナダ
電源	China tech Co.、台湾、新北市	YP30-3-2
リボフラビン5'-リン酸	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	R7774
RNアーゼ	ニューイングランド バイオラボ社 マサチューセッツ州イプスウィッチ
太陽光発電メーター	Tenmars Electronics Co.、台北、台湾	TM-207
黄色ブドウ球菌亜 種	生物資源収集研究センター(BCRC)、新竹、台湾	10451
紫外可視光学分光計	Ocean Optics、フロリダ州ダニーデン	USB4000
紫外可視分光光度計	日立ハイテクサイエンス株式会社、東京、日本	U-2900型
バイオレットLED	Long-hui Electronic Co., LTD, 東莞, 中国