活性酸素種生成による光誘起細菌不活化の定量化

この記事について

要約

このビデオでは、L-メチオニン、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)を含む緩衝反応混合物に紫色の光を照射し、活性酸素種(ROS)の生成を誘導します。これにより、細菌が不活化され、分光法で検出可能なホルマザンが形成されます。

プロトコル

1. 黄色ブドウ球菌の活性酸素種(O₂・⁻)の検出

黄色ブドウ球菌サンプルを調製します。
サンプルの細菌密度を滅菌水で600 nmで0.5の光学密度に希釈します(OD(光学密度)₆₀₀、~6 x 10⁶ CFU(コロニー形成単位)/mL)。0.5 mLの培養物を1.5 mLの遠心分離管に移します。14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントして細胞ペレットを得る。
0.1093 gのL-メチオニン、0.1 gのNBT(ニトロブルーテトラゾリウムクロリウム)、および25 mLのFMN(フラビンモノヌクレオチド)(400、240、または120 μM)を75 mLのPB(リン酸緩衝液)に加えます。適用された反応物1 mLごとに、FMN、メチオニン、およびNBTの最終濃度は、それぞれ100(60または30)×10^〜6 M、7.3×10^〜3 M、および1.2×10^〜3 Mです。
得られた細胞ペレットに各反応物溶液(すなわち、FMN濃度を変化させる)を1 mL加えます。溶液を紫色の光で10 W /^{m 2} で10分間照射します。
混合物を14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントします。ペレットを1 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁して、還元されたNBTを抽出します。生成されたO₂•⁻種を560 nmの吸光度から検出します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	190186
赤外線温度計	Raytek Co. カリフォルニア州サンタクルーズ	MT4の
LBブロス	ニュージャージー州ディフコ株式会社
L-メチオニン	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	1.05707
NBT(ニトロブルー塩化テトラゾリウム)	Bio Basic, Inc. マーカム、オンタリオ州、カナダ
電源	China tech Co.、台湾、新北市	YP30-3-2
リボフラビン5'-リン酸	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	R7774
太陽光発電メーター	Tenmars Electronics Co.、台北、台湾	TM-207
黄色ブドウ球菌亜種	生物資源収集研究センター(BCRC)、新竹、台湾	10451
紫外可視光学分光計	Ocean Optics、フロリダ州ダニーデン	USB4000
紫外可視分光光度計	日立ハイテクサイエンス株式会社、東京、日本	U-2900型
バイオレットLED	Long-hui Electronic Co., LTD, 東莞, 中国

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