活性酸素種生成による光誘起細菌不活化の定量化

要約

出典: Cheng、C.、 et al.リボフラビン‐5′‐りん酸の可視光光分解による病原体の不活性化J. Vis. Exp. (2022)。

このビデオでは、L-メチオニン、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)を含む緩衝反応混合物に紫色の光を照射し、活性酸素種(ROS)の生成を誘導します。これにより、細菌が不活化され、分光法で検出可能なホルマザンが形成されます。

プロトコル

1. 黄色ブドウ球菌の活性酸素種(O₂・⁻)の検出

1. 黄色ブドウ球菌サンプルを調製します。
2. サンプルの細菌密度を滅菌水で600 nmで0.5の光学密度に希釈します(OD(光学密度)₆₀₀、~6 x 10⁶ CFU(コロニー形成単位)/mL)。0.5 mLの培養物を1.5 mLの遠心分離管に移します。14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントして細胞ペレットを得る。
3. 0.1093 gのL-メチオニン、0.1 gのNBT(ニトロブルーテトラゾリウムクロリウム)、および25 mLのFMN(フラビンモノヌクレオチド)(400、240、または120 μM)を75 mLのPB(リン酸緩衝液)に加えます。適用された反応物1 mLごとに、FMN、メチオニン、およびNBTの最終濃度は、それぞれ100(60または30)×10^〜6 M、7.3×10^〜3 M、および1.2×10^〜3 Mです。
4. 得られた細胞ペレットに各反応物溶液(すなわち、FMN濃度を変化させる)を1 mL加えます。溶液を紫色の光で10 W /^{m 2} で10分間照射します。
5. 混合物を14,000 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントします。ペレットを1 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁して、還元されたNBTを抽出します。生成されたO₂•⁻種を560 nmの吸光度から検出します。

材料