抗生物質を充填したポリマーストリップの抗菌効果の決定

要約

出典: Sekar, A., et al., A Novel Method to Determine the Longitudial Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials. J. Vis. 経験。 (2023年)

このビデオでは、抗生物質に曝露された細菌培養物で減少するATP駆動の発光を定量化することにより、抗生物質を充填したポリマーストリップの抗菌効果を評価するための発光ベースのアッセイを紹介します。

プロトコル

時間依存性抗菌活性研究のセットアップ

1. 細菌を1 mLのTSB(トリプシン大豆ブロス)ブロスで一晩培養します。
2. 一晩増殖した細菌懸濁液を滅菌MHB(ミューラー・ヒントンブロス)で10⁵ CFU/mLに希釈し、実験を開始する前に発光ユニットを使用して生存細菌数を検証します。
3. バージンUHMWPE(超高分子量ポリエチレン)と薬剤を充填したUHMWPEストリップ(3 mm x 5 mm x 10 mm)を3 mLシリンジに入れます。
4. 10⁵ CFU/mLを含むMHBを、付属の針を通して1.35 mLのMHBに相当する1.5 mLマークまでシリンジに引き込みます(図1:ステップ1)。
5. シリンジセットアップを37°Cの振とうインキュベーター(100 rpm)に、指定された時点(6時間、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、および7日目)まで置きます(図1:ステップ2)。
6. 示された各時点で、シリンジのセットアップを取り出し、100 μLの細菌懸濁液に対してリアルタイムの微生物生存率アッセイを実行します(図1:ステップ3-4)。
   1. 白色の不透明な底の96ウェルプレートを使用して、発光ベースのアッセイを実行します。
   2. 100 μLの希釈した細菌懸濁液を100 μLのアッセイ試薬と混合します。
   3. 準備した96ウェルプレートの上にアルミホイルで覆われた蓋を置き、100rpm振とうしながら5分間インキュベートします。
   4. Gen5 3.11ソフトウェアの次の設定を使用して、マイクロプレートリーダーですぐに発光を測定します。
      1. [ 新規 ] をクリックして、[ タスク マネージャー] ウィンドウでプロトコルを設定します。
      2. [プレートタイプ]のドロップダウンメニューで[Costar 96 white opaque]を選択します。
      3. [Select Steps > Actions] メニューの [Read] をクリックします。
      4. [読み取り方法]ウィンドウ内の[発光]をクリックします。[Endpoint/kinetic] と [Luminescence fiber] オプションをそれぞれ [read type] と [Optics type] で選択したままにします。[OK]をクリックします。
      5. リード ステップ ウィンドウの<デフォルト>設定のままにします(ゲイン = 135、積分時間 = 1秒、リード高さ = 4.5 mm)。[ OK]をクリックします。
      6. プレートレイアウトウィンドウが表示され、実行の準備が整いました。ロード プレート ウィンドウの [蓋を使用] ボックスをオンにして、[ OK] をクリックします。
      7. 96ウェルプレートを機械に入れて、発光値を読み取ります。
7. 6 時間、1 日目、2 日目、3 日目、および 7 日目の時点の生菌数を決定します。対応する標準曲線を使用して、発光単位からCFU(コロニー形成単位)/ mLを決定します。
8. TSA(トリプシン大豆寒天培地)プレート上でスプレッドプレート法を実行し、35°Cで一晩インキュベートすることにより、検出限界を下回る発光値を示したサンプルに生菌がないことを確認します。翌日、コロニーの存在を確認します。
9. 残りの細菌懸濁液を10,000 × gで10分間遠心分離し、使用済み培地を穏やかに吸引します。薬剤の抗菌活性によりペレットが目視で観察されないチューブの場合は、目に見えないペレットが乱されないように、チューブ内に100 μLを残します(図1:ステップ5)。
10. ペレット化された細菌を新鮮なMHBに再懸濁し、付属の針を通して細菌懸濁液を同じシリンジセットアップに引き戻します(図1:ステップ6)。

結果

図1:実験セットアップの概略図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ATCC 12600	アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州、アメリカ
BacTiter-Glo微生物細胞生存率アッセイ	Promega Corporation、米国	G8231
BD バクト トリプシン大豆ブロス (大豆カゼイン消化培地)	ベクトン・ディキンソン、米国	BD 211825	米国フィッシャーサイエンティフィック社から購入
BD ルアーロックシリンジ滅菌、使い捨て、3 mL	BD, アメリカ	309657
BDニードル5/8インチ使い捨て, 滅菌, 25 G	BD, アメリカ	305122
BD BBL 脱水培地:Mueller Hinton II ブロス (陽イオン調整済み)	ベクトン・ディキンソン、米国	B12322	米国フィッシャーサイエンティフィック社から購入
BD Difco 脱水培地: トリプシン大豆寒天培地 (大豆カゼイン消化寒天培地)	ベクトン・ディキンソン、米国	DF0369-17-6	米国フィッシャーサイエンティフィック社から購入
硫酸ゲンタマイシン	Fujian Fukang Pharmaceutical Co.、福州、中国
LSE卓上振とうインキュベーター	米国ニューヨーク州コーニング
プレートリーダー(Synergy H1	Biotek、バーモント州、米国
シェーカー イノーバ 2100	ニューブランズウィック・サイエンティフィック、ニュージャージー州、米国
UHMWPE	GUR1020, セラニーズ, テキサス州, アメリカ合衆国
バンコマイシン塩酸塩	Fagron, オランダ	804148