マイクロ流体パターニングと蛍光に基づく単一細胞細菌増殖の追跡

要約

出典: Pioli、R.、 et al.、 シーケンシャルキャピラリティアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング。 J. Vis. 経験。 (2021年)

このビデオでは、カーボンフリー懸濁液と制御されたフローを使用して、マイクロ流体トラップで単一の蛍光タグ付き 大腸菌(大腸菌) 細胞を捕捉し、続いて栄養素を添加して成長とマイクロコロニーの蛍光イメージングを誘発する方法を示します。

プロトコル

1. 細菌のパターニング

1. 実験の1日前に、大 腸菌 (MG1655 prpsM-GFP株)の集団を増殖させます。凍結ストックから直接培養物を接種し、37°Cのシェーカーインキュベーターで溶原性ブロス(LB)培地で20時間一晩増殖させます。細胞に50 μg/mLのカナマイシンを加えて、prpsM-GFP(緑色蛍光タンパク質)プラスミドを保持します。
2. 実験当日、実験の数時間前にボックスインキュベーター(図1A)を37°Cに設定し、開始前に均一で安定した温度を確保します。次に、シリンジポンプと加熱されたガラス板を顕微鏡ステージにセットアップし(図1B、C)、ボックスインキュベーターと同じ温度に温度を設定します。
   手記： 顕微鏡を含むシステム全体(図1E)が封入されたボックスインキュベーターは、チャネルが培地で洗い流されたときに、実験全体を通して均一で一定の温度が維持されることを保証します。
3. 実験の90分前に、マイクロ流体チップを100%エタノール(EtOH)で満たされた容器に入れ、チャネルを100%EtOHで少なくとも10分間洗い流します。マイクロ流体チップを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間脱気します。EtOHを蒸留水と交換し、チップを少なくとも30分間真空処理します。マイクロ流体チップを70°Cのオーブンに10分間入れて、チャネルに残っている液体の痕跡を取り除きます。
   手記： このステップは、培地で洗い流したときにチャネル内に気泡が形成されるのを防ぐために必要です。
4. 1 mLの3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)培地(1x)を遠心分離バイアルにピペットで入れ、10 μLの0.132 Mリン酸カリウム(K₂HPO₄)を加えます。37°Cのインキュベーターから一晩培養物を取り出し、100 μLを遠心分離バイアルに分注し、培養物を2,300 × g で2分間遠心分離します。遠心分離バイアルから上清をそっとピペットで取り出し、0.015% v/v のトゥイーン 20 と 0.01% v/v のリン酸カリウムを含む 1 mL の新鮮な MOPS 培地にペレットを再懸濁します。
   手記： 細菌懸濁液の典型的な濃度は0.015〜0.15vol%の範囲であり、これにより、拡張された可動性蓄積ゾーンの形成が保証され、基質上への粒子の蓄積が防止されます。一晩培地を新鮮な培地に交換すると、テンプレート上に細菌の膜が放出されるリスクが最小限に抑えられます。新鮮な培地に炭素源がないため、テンプレートパターニング中に懸濁液中で細胞が増殖するのを防ぎます。PDMSテンプレート上の後退液の接触角が30〜60°の最適な範囲内に収まるには、懸濁液中の0.015%v / vのTween 20の濃度が必要です。
5. 細菌懸濁液を1mLシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。
   1. シリンジとチューブの接続を固定するには、外径0.6mmの針をチューブに直接挿入します。入口付近に残っている懸濁液がチャネル全体に飛散しないように、入口として使用される穴ではなく、パターニングプロセス中に出口として使用される穴(図2A-III)を通して新鮮な培地を洗い流します。
   2. シリンジをシリンジポンプに取り付け、懸濁液がテンプレート領域をトラップで覆うまで、チャネルの上流部分にある入口からマイクロ流体チップに懸濁液を注入します。手記： 液体注入プロセス中、空気はチャネルの下流端にある出口から逃げる可能性があります。
   3. シリンジポンプを0.07〜0.2μL / minの流量で細菌懸濁液(図2A-I)を回収するように設定し、これは記載された形状では80〜100μm / minのメニスカス後退速度に対応します。
   4. 顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを監視します。
      手記： ここでは、10倍の倍率を使用してテンプレート上の後退するメニスカスを監視し、20倍の倍率を使用して、微細加工されたトラップへの個々の細菌の沈着を監視しました。
6. テンプレートが細胞でパターン化されたら(図2A-II)、引き抜き流量を上げてマイクロ流体チャネルをすばやく空にし、少なくとも30分間脱気し、30°Cで予熱した新鮮なLBで洗い流します。
7. シリンジポンプを2 μL/minの流量に設定して、チャネルを優しく洗い流します。チャネルが満たされたら、特定の実験ニーズに応じて流量(15 μL / min)を増やします。
8. 増殖中の細菌を希望の倍率と時間間隔で画像を取得します。

結果

図1:マイクロ流体チャネルでの逐次毛細管支援アセンブリ用のプラットフォームの概略図。 (A)ボックスインキュベーター。ボックスインキュベーターは、マイクロ流体チャネル内で均一で一定の温度(ここでは30°C)を維持します。(B)液体懸濁液を充填したシリンジ。シリンジはシリンジポンプ(図示せず)によって制御され、パターニングプロセス中の液体の動きを制御するために使用されます。(C)加熱ガラス板。加熱されたガラス板はマイクロ流体チャネルの下に配置され、テンプレート全体で均一な温度(こ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BD 10 mLシリンジ(ルアーロック)	BDの	300912	新鮮な溶原性ブロスをマイクロ流体チャネルに洗い流すために使用されます
ボックスインキュベーター	ライフイメージングサービス		チャネル内の温度を均一かつ一定に保つために使用されます
遠心機	エッペンドルフ	5424R型	オーバーナイトメディアを新しい最小限のメディアに置き換えるために使用します
遠心分離機バイアル	エッペンドルフ	30120086	1.5ミリリットル
セトーニベース120	CETONI GmbH		シリンジポンプ
H401-T-コントローラー	オコラブ		加熱ガラス板のコントローラー
H601-NIKON-TS2R-ガラス	オコラブ		加熱ガラス板
インスリンシリンジ、U 100、ルアー付き	Codan Medical ApS	CODA621640	パターニングプロセス中に液体懸濁液を抽出するために使用される1mLシリンジ
LBブロス、ミラー(ルリア・ベルタニ)	フィッシャーサイエンティフィック	244610	溶原性ブロスをマイクロ流体チャネルに洗い流す
Masterflexトランスファーチューブ	マスターフレックス	HV-06419-05	0.020インチ内径、0.06インチ外径
モップ (10x)	テクノバ	M2101	ミリQ水で10倍に希釈し、オーバーナイト培地の代わりに使用します
ニコン エクリプス Ti2	ニコンインスツルメンツ		顕微鏡
リン酸二塩基性カリウム	シグマ・アルドリッチ	P3786	MOPS 1xに追加
トゥイーン20	シグマ・アルドリッチ	P1379	パターニングプロセス中に最適な後退接触角を確保するために使用されます