嫌気性条件下で生物学的に利用可能な水銀を検出するための細菌バイオセンサーアッセイ

要約

出典: Stenzler、BR ら、 水銀とカドミウムの検出のための嫌気性バイオセンサーアッセイ。 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、嫌気性条件下で水銀イオンの生物学的利用可能の割合を正確に測定するための遺伝子操作された細菌バイオセンサーの使用を示しています。硫酸マグネシウムの濃度を変化させることにより、蛍光強度の変化によって示されるように、バイオセンサーが遊離水銀イオンに選択的に反応することが保証されます。

プロトコル

1. 暴露アッセイ

1. プレートレイアウトの設計。
   手記：露出アッセイを開始する前に、必ずすべてのピペッティング値を計算し、ストックを準備してください。実験を適切に設計する方法と、どのコントロールを含めるかについては、本文で詳しく説明します。さらに、嫌気性モニターに示されている嫌気性チャンバー内に酸素がある場合は、実験を開始しないでください。
2. 96ウェルテンプレートに従ってプレートレイアウトを設計します。これにより、32の異なる処理で3つの技術的反復で実験を実行でき、バイアルをセットアップするための4 x 8グリッドで最もよく表されます( 図1を参照)。

手記：水銀誘導性バイオセンサーで水銀取り込みに対する変数の役割をテストする場合、各変数に 2 つの処理が必要です: 処理 (バイオセンサー + 水銀 (Hg) + 変数 + 硝酸塩) とその処理ブランク (バイオセンサー + 変数 + 硝酸塩)。構成バイオセンサーを使用して細胞の生理学に対する変数の役割をテストする場合、各変数に対して、処理 (バイオセンサー + 水管 + 変数 + 硝酸塩) と治療ブランク (バイオセンサー + 変数 + 水冷) の 2 つの処理が必要です。水銀はカドミウム(Cd)に置き換えることができます。検量線を実行するときに、Hg または Cd が変数になります。 構成型バイオセンサーと誘導型バイオセンサーを同時に(同じプレートレイアウトで)実行する必要はありません。マグネシウム(可変)の濃度範囲をテストする際のプレートレイアウトと対応する4 x 8グリッドのテンプレート例を表1に示します。

2. アッセイプレートのレイアウトに従って4 x 8グリッドを設定します。

1. 7 mL のポリテトラフルオロエチレン(PTFE)標準バイアルをトレイに入れます。
手記： PTFEバイアルは、使用前に酸洗浄または熱滅菌する必要があります。バイアルの外側を操作することによってのみ取り扱う必要があります。

2. 各バイアルに、各処理に対応する露光培地の容量を追加します。
手記：総容量が2,000 μL(2 mL)の露光では、添加される露光媒体は、露光媒体μL = 2,000 μL – 処理(ブランク)μLになります。(例:露光媒体 μL = 2,000 – 100 μL(バイオセンサー) – 40 μL(硝酸塩) – 100 μL(Hg) – 100 μL(可変(例: 硫酸マグネシウム、MgSO₄)) = 1660 μL)。テスト変数の添加量が最終体積の 5% (100 μL) を超えないようにしてください。

3.プレートレイアウトに従って、テストする化学変数の溶液の対応する容量を各バイアルに追加します。

4.最終濃度が 200 μM (40〜80 μL)になるように、各バイアルに硝酸塩を加えます。 構成的バイオセンサー処理ブランクについては、このステップを除外します。

5. プレートレイアウトに従って、Hg(変数のテストの場合は 5 nM )または Cd(変数のテストの場合は 300 nM )をバイアルに追加します。 水銀誘導性バイオセンサー処理ブランクでは、このステップを除外します。

1. Hgを使用する場合は、 4〜8μM のストックを取り、よく振ってください。7 mL PTFEバイアルの 露光培地 で溶液を 100〜250 nM に希釈して、作業するHg溶液を作ります。この作業溶液から、必要なバイアルに水銀を加えます。この場合、0〜12.5 nMの範囲のHgの検量線。
手記： Hg または Cd のバイオアベイラビリティに対する変数の影響をテストするときは、[Hg] または [Cd] がすべての処理で一定であることを確認してください。HgまたはCdを追加するときは、必ず1つのピペットチップを使用してくださいが、バイアル内の露光媒体には触れないでください。

手動で軌道運動で振る。
手記： HgまたはCdが溶液中でスペシエーションするのに必要な時間に応じて、実験を一時停止することができます。1時間以上放置する場合は、蒸発/汚染を防ぐためにPTFEバイアルにPTFEキャップを取り付けます。

バイオセンサーストックを前後にそっとピペットで移動させ、均一性を確保します。各バイアルに100 μLのバイオセンサーストックを加えます。手動で軌道的に振ってください。

プレートリーダーをウォームアップして次の基準で読み取りを準備します: 37°Cの温度、読み取りの間に軌道振とうをしながら2.5〜5分ごとに読み取りで 10時間 のキネティックラン、および 440 nmの蛍光励起 と 500 nmの発光による蛍光測定。

4 x 8グリッド内の各PTFEバイアルから 200 μL を96ウェルプレート(黒色、96ウェルクリアボトム非結合表面マイクロプレート)の対応するウェルにピペットで入れます。各200 μLを移す前に、ピペットを5回前後にピペットします。注: ピペットチップを廃棄する代わりに、ピペットチップをPTFEバイアルに残して、ピペッティングの進行状況を追跡します。

96ウェルプレートをプレートリーダーのトレイに入れ、96ウェルプレートに蓋を置き、アッセイを開始します。

 

表1:バイオセンサーを使用して、マグネシウム(0〜10 mM)の勾配でHgバイオアベイラビリティ(5 nM)をテストするためのプレートレイアウトの例

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

ある

Hg 誘導バイオセンサー + Hg + 硝酸塩 + 0 mM Mg

Hg 誘導バイオセンサー + 硝酸塩 + 0 mM Mg

構成型バイオセンサー + Hg + 硝酸塩 + 0 mM Mg

構成バイオセンサー + Hg + 0 mM Mg

b

水銀誘発バイオセンサー+ 水銀 + 硝酸塩 + 0.1 mM Mg

水牛誘起バイオセンサー + 硝酸塩 + 0.1 mM Mg

構成バイオセンサー+ Hg + 硝酸塩 + 0.1 mM Mg

構成バイオセンサー + Hg + 0.1 mM Mg

c

水銀誘発バイオセンサー + 水銀 + 硝酸塩 + 1 mM Mg

水牛誘起バイオセンサー + 硝酸塩 + 1 mM Mg

構成型バイオセンサー + 水銀 + 硝酸塩 + 1 mM Mg

構成型バイオセンサー + Hg + 1 mM Mg

d

水銀誘発バイオセンサー + 水銀 + 硝酸塩 + 10 mM Mg

水銀誘起バイオセンサー + 硝酸塩 + 10 mM Mg

構成バイオセンサー + Hg + 硝酸塩 + 10 mM Mg

構成型バイオセンサー + Hg + 10 mM Mg

材料