比色アッセイを用いた細菌膜結合ピロホスファターゼ阻害剤のスクリーニング

要約

出典: Vidilaseris、K.、 et al. Thermotoga maritima 膜結合ピロホスファターゼ阻害剤のスクリーニング J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオでは、オルトリン酸の放出を定量することにより、細菌の膜結合ピロホスファターゼ(mPPase)の阻害剤をスクリーニングするための比色アッセイを示します。この方法により、潜在的な抗菌薬標的である Thermotoga maritima の mPPase を阻害する化合物の同定が可能になります。

プロトコル

1. アッセイ調製用試薬

1. 亜ヒ酸塩 - クエン酸塩溶液を調製します。
   1. 5 gの亜ヒ酸ナトリウムと5 gのクエン酸三ナトリウム二水和物を量ります。
      注意： 亜ヒ酸ナトリウムは有毒です。したがって、適切な保護具を使用し、特別な注意を払って取り扱ってください。予防措置として、必要なすべての安全上の注意事項を読んで理解する前に取り扱わないでください。化合物またはその溶液の粉塵/蒸気を吸い込まないように、ヒュームフードでのみ取り扱ってください。吸入した場合は、新鮮な空気に移動し、医師の診察を受けてください。適切な化学安全ゴーグル、保護手袋、衣服を着用して、摂取や目や皮膚への接触を避けてください。飲み込んだ場合は、すぐに毒物センターまたは医師/医師に連絡してください。皮膚や目に付着した場合は、多量の水で洗い、医師の診察を受けてください。
   2. 100mLの水に溶かします。
   3. 氷酢酸5mLを加えて混合し、水を加えて250mLまで加えます。
   4. 光から保護して室温で保管してください。
      手記： このソリューションは1年以上安定しています。
2. 溶液Aと溶液Bを調製します。
   1. 溶液Aの場合、10 mLの氷冷0.5M HCl(塩酸)を0.3 gのアスコルビン酸に加えます。ボルテックスによってアスコルビン酸を溶解します。
   2. 溶液Bの場合、70mgのヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物に1mLの氷水を加え、ボルテックスして溶解します。
      手記： 使用するまで両方の溶液を氷の上に保管してください。アッセイ結果の一貫性を保つために、両方の溶液を氷上に最大1週間保存できます。
3. キャリブレーション用に、0 μM、62.5 μM、250 μM、および 500 μM の濃度でリン酸塩(Pi)標準を調製します。
   1. 0 μL、25 μL、50 μL、および100 μLの5 mM Na₂HPO₄ (リン酸二ナトリウム)二水和物を、370 μLの反応混合物を含む4本のマイクロチューブに加えます。
   2. 1 mLまで水を注ぎます。

2. 1つの96ウェルプレートの活性アッセイ

手記： アッセイの概略的なワークフローについては 、図1 を参照してください。

1. 溶液A10mLに溶液B1mLを加え、ボルテックスで混合し、氷上に保存します。
   手記： この溶液は透明で黄色でなければなりません。使用前に、溶液A + Bを氷の上に少なくとも30分間保管してください。ただし、長期保管すると悪くなるため、3時間以内に使用してください。
2. マルチチャンネルピペットを使用して、40 μLの0 μM、62.5 μM、250 μM、および500 μM Pi標準をチューブストリップに3回ずつ加えます。
   手記： Piを添加していない反応混合物をブランクとして使用します。
3. マルチチャンネルピペットを使用して、25 μLの化合物溶液をチューブストリップに加えます。
   手記： 各化合物は3つの異なる濃度を3回繰り返しており、最大阻害濃度の半分(IC50)の初期推定には十分です。より正確なIC50測定のために、8つの異なる化合物濃度を使用できます。抑制されていない酵素の場合、複合溶液を同量の水に置き換えます。ポジティブコントロールとして、2.5 μM、25 μM、および250 μMのイミドジリン酸(IDP)ナトリウム塩を使用しました。
4. マルチチャンネルピペットを使用して、15 μLのmPPase(膜結合ピロホスファターゼ)溶液混合物をチューブストリップ(Pi標準を含むチューブを除く)に加えます。
5. チューブストリップを粘着シールシートでシールします。シーリングシートをカットして、各チューブストリップを分離します。
6. サンプルを71°Cで5分間プレインキュベートします。後続のステップでの時間消費を最小限に抑えるために、各ストリップの間に20秒間隔でサンプルを加熱ブロックに置きます。
7. ストリップごとに、接着剤シールを開きます。マルチチャンネルピペットを使用して10 μLの2 mMピロリン酸二塩基性ナトリウムを加え、5×上下にピペッティングして混合します。同じシールを使用してチューブストリップを再度シールします。
   手記： このステップは、最初は 20 秒で完了するのが難しい場合があります。ただし、いくつかのアッセイの後は簡単になります。
8. 71°Cで5分間インキュベートします。
9. サンプルを各ストリップの間に20秒間隔で冷却装置に置きます。10分間冷却しますが、5分間冷却した後、各ストリップを短時間遠心分離して、シーリングシートの下に水滴をデカントしてから、冷却装置に戻してシーリングを取り外します。
   手記： 冷却装置は、水で満たされたポリスチレンペトリ皿(サイズ150mm×15mm)に96ウェルPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)プレートを置き、少なくとも1時間凍結することによって簡単に作ることができます。装置は、アッセイ開始の約5分前に冷凍庫から取り出す必要があります。サンプル冷却の直前に冷却装置を取り出すと、反応混合物が凍結し、発色が妨げられます。
10. 10分間冷却した後、60 μLの溶液A + Bを加え、上下に5×ピペッティングして混合し、チューブストリップを冷却装置に10分間保持します。
11. 90 μLの亜ヒ酸塩-クエン酸塩溶液を加え、室温で少なくとも30分間保持して、安定した青色を生成します。
    注意： その毒性のため、亜ヒ酸ナトリウムを含むすべての溶液は常に特別な注意を払って取り扱う必要があります。したがって、亜ヒ酸塩 - クエン酸塩溶液の添加はヒュームフードで行う必要があります。
12. 各反応混合物180 μLを透明な96ウェルポリスチレンマイクロプレートに分注します。
13. マイクロプレート分光光度計を使用して、860 nmで各ウェルの吸光度を測定します。

結果

図1:96ウェルプレートフォーマットでのTmPPase阻害アッセイの概略的なワークフロー。 赤い番号はプロトコルに従ったアッセイのステップを示し、青い矢印は間隔の順序を示します。TmPPase:好熱性細菌Thermotoga maritima由来のmPPase。

材料