細菌胞子の内膜における発芽タンパク質の可視化

要約

出典: Wen、J.、Pasman、 他、 枯 草菌 胞子におけるゲルミノソームと内膜の視覚化。 J.Vis.エクスプション。 (2019年)

このビデオでは、構造化照明顕微鏡を使用して、細菌胞子内の発芽タンパク質の組織化を明らかにする3次元蛍光画像を取得する方法を示します。

プロトコル

1. 発芽タンパク質イメージング(タイミング:1時間)
   1. 100倍のオイル対物レンズ(開口数= 1.49)、CCD(電荷結合素子)カメラ、および画像解析ソフトウェア( 材料表を参照)を備えた構造化照明顕微鏡( 材料表を参照)で、胞子の透過画像と蛍光画像、および赤と黄緑のカルボン酸修飾蛍光微小球の混合物をキャプチャします( 材料 表を参照)).周囲光の邪魔を受けることなく、室温ですべての画像を生成します。イメージングする前に、必ず100倍対物レンズとスライドを75%エタノールで洗浄してください。
   2. 100 nm(直径)の蛍光微小球に焦点を合わせ、対称的なpsfが得られるまで100倍対物レンズの補正リングを調整することで点拡散関数(psf)を最適化し、画像のぼやけを最小限に抑えます。psf は、インパルス応答、または点源または点オブジェクトに対するイメージング システムの応答です。
   3. 約10個の丸い蛍光マイクロスフェアを含む視野を選択します。画像解析ソフトウェアのガイドとして、561 nmと488 nmの両方の励起波長にグレーティングフォーカス調整を適用します。
   4. 透過光で胞子に焦点を合わせ、16×平均モードで各画像の露出200msで透過光画像をキャプチャします。
   5. 照明モード「3D-SIM」、カメラ設定を読み出しモードに設定し、電子増殖(EM)ゲイン10MHz(14ビット)、EMゲイン175で、胞子の3D-SIM生の蛍光画像をキャプチャします。PS4150胞子のFM4-64プローブを、20%のレーザー出力で561nmのレーザー光、400msの照明時間で励起します。
   6. KGB80胞子中のGerKB-mCherryおよびGerD-GFPを、それぞれ30%のレーザー出力で561 nmのレーザー光を1秒間、および60%のレーザー出力で488 nmのレーザー光を3秒間で励起します。Zスタック設定は、上から下へのモード、0.2μm/ステップです。
      手記： これらのレーザーパラメータは、ヒストグラムウィンドウの最大輝度値を約4,000にするために適用されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
空気乾燥スライドガラス	メンツェル・グレーザー	630-2870
APO TIRF N20R8 100×オイル対物レンズ(NA=1.49)
枯草 KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mチェリーキャット、gerD-gfp kan)
枯草 PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
FluoSpheresカルボン酸修飾マイクロスフェア	インビトロゲン、0.1 μm	F8803
FM4-64	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F34653
ヒストデンツ非イオン密度勾配媒体	シグマ・アルドリッチ	D2158
画像J
iXON3 DU-897 X-6515 CCDカメラ	アンドールテクノロジー		https://imagej.net/Welcome
顕微鏡イメージングソフトウェア	ニコン、日本	NISエレメントAR 4.51.01
MilliQ 超純度脱塩水	ミリポール	ミリQIQ 7003
ニコンEclipse Ti顕微鏡
精密カバースリップ	ポール・マリエンフェルド	117650
スクリューキャップチューブ 50 mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック		ヌンクTM