細菌摂食支援によるエレクトロポレーションによる野生型アメーバのトランスフェクション

要約

出典:Paschke、P.、 et al. 細菌の選択と増殖に基づく Dictyostelium discoideum 細胞の遺伝子工学。J. Vis. Exp. (2019)。

このビデオでは、標的遺伝子を運ぶプラスミドをエレクトロポレーションによってアメーバ細胞に導入し、その後細菌サプリメントで回収して野生型アメーバに効率的な遺伝子送達を可能にする手順を示します。

プロトコル

1. トランスフェクション用のDictyostelium細胞のセットアップ
   1. クレ ブシエラエアロゲネス を、SM(スキムミルク)培地(栄養豊富な培地)でRT(室温)で一晩合流するように成長させます。培養物は4°Cで最大2週間保存できます。
   2. この細菌懸濁液を約400 μLをSM寒天プレート(ペプトン10 g / L、酵母抽出物1 g / L、グルコース10 g / L;KH₂PO₄ 1.9 g/L;K₂HPO₄ x 3 H₂O、1.3 g/L;MgSO₄ 無水 0.49 g/L;1.7%寒天)を均一に広げます。滅菌ループを取り、 Dictyostelium 細胞を接種します。プレートの片方の端にセルを広げます。
   3. プレートを22°Cで2日間インキュベートして、トランスフェクションに十分な増殖ゾーンを確保します。
      手記： 大きな成長ゾーン(Ax3、DH1、JH10など)を作らないDictyostelium株の場合、または経験の浅い実験者の場合は、代わりにクリアリングプレートを使用してください。
   4. 滅菌ループを取り、 Dictyostelium 細胞(約2〜4 x 10⁵ 細胞)を接種します。細胞をSM中の800 μLの高密度 K.aerogenes 懸濁液に移します。上下にピペッティングして細胞を混合します。
   5. 400 μL、200 μL、100 μL、および50 μLを新鮮なSM寒天プレートに移します。各プレートに400 μLの追加SM K. aerogenes 懸濁液を加え、均一に広げて乾燥させます。
   6. プレートが半透明になるまで、プレートを22°Cで約2日間インキュベートします。
      手記： バクテリアは成長速度が速いため、最初は合流した芝生を作り、その後アメーバはバクテリアのプレートを「クリア」します。このプロセスに必要な時間は、株の背景と変異細胞が細菌上で増殖する能力によって異なります。

2. 細菌選択に基づくDictyostelium細胞のトランスフェクション

1. K. aerogenes懸濁液を含むプレートを調製するには、K. aerogenes細菌を含むSorMCバッファー10 mLをOD(光学密度)₆₀₀ = 2の密度に加えます(調製したOD₆₀₀ = 100 K. aerogenesストック溶液を200 μLを所望の細菌濃度に加えます)10 cmの組織培養処理シャーレに。
   手記： このプレートは、後でトランスフェクトされた D.discoideum 細胞を培養するために必要になります。あるいは、6ウェル組織培養プレートを使用することもできます。染色体外プラスミドのトランスフェクションの場合、6ウェル組織培養プレートの方が資源効率が高くなります。ウェルあたり2 mLの K. aerogenes SorMC(OD₆₀₀ = 2)懸濁液を使用します。
2. Dictyostelium細胞の調製
   1. 10 μLの使い捨て接種ループを使用して、培養プレート(クリア領域の端)またはクリアリングプレートの増殖ゾーン(約3 cm)から細胞を掻き取ります。1 mLの氷冷H40バッファーを含む1.5 mLチューブに細胞を移します。
      手記： クリアプレートから細胞を採取するタイミングは非常に重要です。採取が早すぎると細胞の量が少なくなり、採取が遅すぎると部分的に発達した細胞が得られるリスクが高まります。
   2. 1,000 x g で 2 分間スピンダウンするか、10,000 x g で 2 秒間フラッシュスピンして細胞を洗浄します。上清を廃棄し、細胞をH40バッファーに再懸濁し、最終密度は2〜4 x 10⁷ 細胞/mLになります。トランスフェクション手順全体を通して細胞を冷たく保ちます。氷水スラリーを使用して、チューブと氷が直接接触するようにします。
3. エレクトロポレーション
   1. 1〜2μgのDNA(デオキシリボ核酸)を含むチューブに100 μLの細胞を加えます。上下にピペッティングして慎重に混合します。
   2. 細胞/DNA混合物を、事前に冷却されたエレクトロポレーションキュベット(2 mmのギャップ)に移します。
   3. 次の方形波設定を使用してセルをパルスします:350 V、8 ms、2パルス、および1秒のパルス間隔。
      手記： 2μgを超えるDNAは添加しないでください。量が多いと細胞に毒性があり、トランスフェクション効率が低下します。添加されたDNAの総量は5 μLを超えてはなりません。
   4. 細胞をK.aerogenes SorMCで以前に調製した10 cmペトリ皿にすぐに移し、細胞を5時間回復させます。
      手記： ペトリ皿内の細胞を倒立顕微鏡で確認します。細胞はエレクトロポレーション直後に丸く見えますが、表面に適切に付着するのに十分な時間が経過した約30分後にアメーバの形に戻ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エッペンドルフ微量遠心分離機 5424/5424R	サーモサイエンティフィック	05-400-002
Eppendorf 5702R 遠心分離機 A-4-38 モデルローター付き	サーモサイエンティフィック	12823252
安全キャビネット Foruna - SCANLAF	ラボジーン
バイオフォトメータープラス	エッペンドルフ
CLSM710	ツァイス
精製寒天	オキソイド	LP0028
SMスープ	ミディアム用	SMB0102
2x LBブロス	ミディアム用	LBD0102
HEPES遊離酸	シグマ・アルドリッチ/メルク	391340 EMD型
KH₂PO₄	VWRの	P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWRの	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	シグマ・アルドリッチ/メルク	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	シグマ・アルドリッチ	442909
葉酸	シグマ・アルドリッチ	F7876
島	VWRの	26668.263
100 x 20 mmスタイルの組織培養皿、組織培養処理済み	コーニング株式会社	353003
2mmギャップエレクトロポレーションキュベット、長電極	ジェネフローリミテッド	E6-0062
10 μl 接種ループ、ブルー 10 マイクロ L	サーモサイエンティフィック	129399
スプレッダー、L字型、滅菌	グライナーバイオワン	730190