単一細胞細菌相互作用の可視化

要約

出典: Yarringto、K.D.、 et al. 単一細胞種間細菌相互作用の速度論的可視化 J. Vis. 経験。 (2020年)

このビデオでは、生細胞イメージング用のアガロースパッドの下で運動性細菌と非運動性細菌を使用した共培養システムの調製を示します。これは、運動性細菌がどのように化学誘引物質を検出し、非運動性コロニーに侵入するかを示し、細菌の相互作用を明らかにします。

プロトコル

1. 細菌細胞と接種パッドの調製

1. 各継代培養の光学密度OD₆₀₀を測定し、緑 膿 菌をOD₆₀₀ = 0.03に希釈し、黄色 ブドウ球菌 を37°Cに予熱したM8T(ミニマル培地8 +トリプトン)でOD₆₀₀ = 0.10に希釈します。 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌 を1:1の比率で混合し、ボルテックスします。
   手記： 菌株に抗生物質が必要な場合は、一晩および継代培養に追加できますが、共培養内の他の種に影響を与える場合は、イメージングのために種を混合するときに追加しないでください。プラスミドの安定性と、共培養内のすべての種に対する抗生物質の影響は、使用される生物/プラスミドごとに決定する必要があります。
2. 予熱した滅菌済みの35 mmガラスカバーガラス皿の底に1 μLの共培養物を均一にピペットでかけます。
3. 滅菌ピンセットを使用して、シリコンの切り欠きを型から取り除きます。
4. 滅菌スパチュラを使用して皿からパッドを取り除きます。
   1. 少し曲げたスパチュラをパッドの端の下に滑り込ませ、型を逆さまにして滅菌ペトリプレートの蓋に落とします。
      手記： パッドを無理に引き出さないでください。パッドのどちら側が底であるかを追跡します。
5. 90°の角度のスパチュラをパッドの下にスライドさせ、接種したカバーガラスの上に置き、細菌細胞のある皿にパッドを下向きに移します。90°の角度のスパチュラを使用して、パッドをカバーガラスと同じ高さにし、気泡をそっと押し出します。
6. 湿ったおしりふきから余分な水分を取り除き、パッドに触れないように皿の端に置きます。これで、サンプルをイメージングする準備が整いました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロースパッド
35mmガラス底皿、20mmマイクロウェル、1.5カバーガラス	セルビス	D35-20-1.5-N	1つはアガロースパッド型用、もう1つは実験用
丸先細スパチュラ	VWRの	82027-530
シリコンアイソレーター、プレス・トゥ・シール、1ウェル、直径2.0 mm、20 mm、シリコン/接着剤	シグマ・アルドリッチ	S6685-25EA	アガロースパッド型用
ピンセット	VWRの	89259-944
M8Tミニマルメディア
D(+)グルコース	RPIの	G32045
KH₂PO₄	RPIの	P250500
MgSO₄	シグマ・アルドリッチ	208094
NaCl	RPIの	S23025
Na₂HPO₄・7H₂O	シグマ・アルドリッチ	230391
トリプトン	BDバイオサイエンス	DF0123173
細菌株
緑膿菌 PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)	PMID:9361441
黄色 ブドウ 球菌 USA300 LAC (WT)	PMID:23404398		USA300 プラスミドなしの CA-メチシリン耐性株 LAC