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1. Triton X-114 (TX-114) 相分配によるリポタンパク質の濃縮
- 氷冷のトリス緩衝生理食塩水/エチレンジアミン四酢酸(TBSE)に等量の4%(vol / vol)界面活性剤を添加することにより、細菌ライセートにTX-114界面活性剤を2%(vol / vol)の最終濃度まで補充し、氷上で1時間インキュベートし、~15分ごとに反転して混合します。
手記： 冷やすと、上清と界面活性剤が混和します。 - チューブを37°Cのウォーターバスに移し、10分間インキュベートして相分離を誘導します。サンプルを室温で10,000 x g で10分間遠心分離し、二相分離を維持します。
- 上部の水相をそっとピペットで取り除き、廃棄します。氷冷したTBSEを界面活性剤の下部相に加えて、チューブを元の容量まで補充し、反転させて混合します。氷上で10分間インキュベートします。
- チューブを37°Cのウォーターバスに移し、10分間インキュベートして相分離を誘導し、室温で10,000 x g で10分間遠心分離します。
- 手順1.3〜1.4をもう一度繰り返して、合計3回分離します。上部水相を取り除き、廃棄します。
- 界面活性剤相に1容量の氷冷TBSEを加えることにより、抽出の過程で形成された沈殿タンパク質のペレット(チューブの底に見える)を除去します。4°Cで16,000 x g で2分間遠心分離し、不溶性タンパク質をペレット化します。
手記： サンプルは単相のままにする必要があります。相分離が発生した場合は、サンプルを再冷却し、再度遠心分離します。ペレットは一般に非リポタンパク質汚染物質で構成されていますが、さらなる分析のために保持することができます。 - すぐに上清を1250 μLの100%アセトンを含む新しい2.0 mL微量遠心チューブに移します。サンプルは粘性になるため、サンプルを上下にピペットで完全に洗浄します。反転で混合し、-20°Cで一晩インキュベートしてタンパク質を沈殿させます。
- サンプルを室温で20分間16,000 x gで遠心分離し、チューブの向きに注意しながらリポタンパク質をペレット化します。リポタンパク質は、チューブの外壁に沿って薄い白い膜を形成します。
- ペレットを100%アセトンで2回洗浄します。アセトンをデカントし、サンプルを自然乾燥させます。
- 20-40 μLの10 mMトリス塩酸塩、pH 8.0、または標準的なLaemmli SDS-PAGEサンプルバッファーを加え、沈殿したリポタンパク質で壁に対して上下にピペッティングして完全に再懸濁します。ピペットチップでチューブの側面をこすり、リポタンパク質を取り除きます。
手記： リポタンパク質はトリスバッファーに溶解せず、懸濁液を形成します。- リポタンパク質は使用まで-20°Cで保管してください。