ヒトノロウイルスの細菌由来組換えPドメインタンパク質の精製

要約

出典: Leuthold、MM、 et al. X線結晶学のための大 腸菌 におけるヒトノロウイルス突出ドメインの産生 J. Vis. 経験。 (2016)。

このビデオでは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した組換えヒトノロウイルスPドメインの精製をデモンストレーションし、細孔アクセシビリティの違いに基づいて、高分子量および低分子量の不純物から標的タンパク質を分離することを強調しています。このプロセスはUV吸光度によって監視され、溶出画分のSDS-PAGE分析によって確認されます。

プロトコル

1. 3次精製ステップ

1. HPLC(高速液体クロマトグラフィー)精製システムのポンプとパイプを洗浄し、SEC(サイズ排除クロマトグラフィー)カラム(材料リストを参照)をGFB(ゲルろ過バッファー)でプレ平衡化します。
2. 濃縮サンプルの容量に応じて、スーパーループ(最大12 ml)またはループ(最大3 ml)を使用して、1 ml/分の流速でPドメインをカラムに注入します。注入が終了したら、流量を2.5ml/分に上げます。
3. OD(光学密度)が増加し、Pドメインがカラムから外れたら、1.5mlの画分を回収します。12%ゲルを含むSDS-PAGEを使用してフラクションをチェックします(図1Aおよび1B)。最も純粋な画分のみをプールし、~3 mg/mlおよび~8 mg/mlに濃縮します。
   注:~110 ml(ボイド容量)の後、ほとんどの不純物は320 mlのベッド容量のSECカラムから溶出されます。Pドメインは通常、二量体として溶出されます。Pドメイン二量体の溶出時間/体積は、SECカラムの調製グレード(pg)に依存します。

結果

図 1.第3精製ステップの概略的で代表的な結果。
SECを用いたPドメイン溶出のクロマトグラムと対応するSDS-PAGE結果。黒い数字は、収集される分数を示します。 A)SECカラム上の分離の概略図(SECビーズは灰色の球体として示されています)。12% SDS-PAGEは、SEC溶出中に回収され、その後プールされてX線結晶構造解析に使用される画分に存在するタンパク質を示します。 B)SECクロマトグラム...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PドメインDNA	ライフテクノロジー		GeneArt遺伝子合成
ビバスピン20	GEヘルスケア	諸	10 kDa、30 kDa、50 kDaのカットオフを使用
ハイロード 26/600 スーパーデックス 75 PG	GEヘルスケア	28-9893-34	SEC列