負イオン交換クロマトグラフィーによる細菌タンパク質の選択的精製

要約

出典:Kuo、T.、et al.大腸菌で過剰発現したHelicobacter pylori好中球活性化蛋白質のバッチモードでのワンステップネガティブクロマトグラフィー精製J. Vis. 経験。(2016年)

このビデオは、細菌の溶解物から病原性関連タンパク質を精製するネガティブクロマトグラフィー技術を示しています。緩衝液中に正電荷を帯びた樹脂を使用することにより、宿主細胞タンパク質は選択的に保持されますが、中性に近い標的タンパク質は結合していないままフロースルーに収集されます。この方法により、下流のアプリケーション向けに標的タンパク質を効率的に分離および回収できます。

プロトコル

1. 大腸菌(大腸菌)における組換えHP-NAPの発現

1. 前述のように、ヘリコバクターピロリ26695株由来のヘリコバクターピロリ好中球活性化タンパク質(HP-NAP)のDNA配列を含むプラスミドpET42a-NAPを調製します。所望の点変異を持つHP-NAPのDNA配列を含むプラスミドを調製します。
2. 上記のDNAプラスミド10 ngを42°Cで45秒間のヒートショックにより大 腸菌 BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、50 μg/mlのカナマイシンを含む溶原性ブロス(LB)寒天プレート上で細胞を縞模様にし、プレートを37°Cで16時間インキュベートします。
3. 5 mlのLBブロスを含む個々のチューブに50 μg / mlカナマイシンを接種し、170 rpmで振とうしながら37°Cで16時間前培養として増殖させます。
4. 上記の前培養細胞2mlを、1Lフラスコ内の50μg/mlカナマイシンを含む200mlのLBブロスに接種します。接種した培養フラスコを37°Cで2時間インキュベートし、600 nmでの吸光度が紫外可視(UV / VIS)分光光度計で検出される約0.4〜0.5に達するまで、170 rpmで振とうします。
5. 80 μlの1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を上記の培養物に最終濃度0.4 mMまで添加し、HP-NAPの発現を誘導します。600 nmでの吸光度が約1.6〜1.7に達するまで、培養物を3時間インキュベートします。
6. 細胞を4°Cで6,000 x g で15分間遠心分離して、上清を除去します。精製するまで細胞ペレットを-70°Cで保存します。

2. HP-NAPを含む可溶性タンパク質画分の調製

手記： 以下のステップはすべて4°Cで実行されます。

1. プロトコルステップ1.6で調製した細胞ペレット50mlを、0.13 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、0.03 mM N-α-トシル-L-リシニル-クロロメチルケトン(TLCK)、および0.03 mM N-トシル-L-フェニルアラニニル-クロロメチルケトン(TPCK)を含む20 mlの20 mM Tris-HCl、pH 9.0、50 mM NaClに再懸濁します。
2. 細菌懸濁液を、15,000〜20,000 psiの範囲で動作する高圧ホモジナイザーに4°Cで7回通すことにより、細菌細胞を破壊します。
3. 細胞ライセートを30,000 × g、4°Cで1時間遠心分離し、超遠心分離機を使用して可溶性タンパク質画分と不溶性タンパク質画分を分離します。可溶性タンパク質画分としての上清をビーカーに移します。
4. 製造元の指示に従って、ウシ血清アルブミン (BSA) を標準として使用した市販のキットを使用して、ブラッドフォード法によって可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度を測定します。
5. プロトコルステップ2.3から得られた可溶性タンパク質画分20mlに177.6μlの1NHClを加え、pH値をpH 9.0からpH 8.0に調整します。
6. 上記のタンパク質溶液に20 mM Tris-HCl、pH 8.0、50 mM NaClを加えて、最終タンパク質濃度を0.5 mg / mlにします。

3. DEAEイオン交換樹脂を用いたネガティブモードバッチクロマトグラフィーによる大腸菌からの組換えHP-NAPの精製

1. ジエチルアミノエチル(DEAE)樹脂15mlを調製します。
   1. 0.6 gのDEAE樹脂の乾燥粉末を秤量し、30 mlの20 mM Tris-HCl、pH 8.0、50 mM NaClに室温で少なくとも1日間懸濁します。
   2. 樹脂を10,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。
   3. 上清を取り除き、廃棄します。
   4. 15 mlの20 mM Tris-HCl、pH 8.0、50 mM NaClを加えます。
   5. プロトコルの手順3.1.2から3.1.4をさらに4回繰り返します。
   6. 15 mlの沈降樹脂(30 mlのTrisバッファーに50%スラリー)を4°Cで保存し、その後使用します。
      手記： 以下のステップはすべて4°Cで実行されます。
2. プロトコールステップ2.6で調製した可溶性タンパク質45mlを15mlの樹脂に加え、タンパク質/樹脂スラリーを4°Cの磁気攪拌機で1時間撹拌します。
3. タンパク質/樹脂スラリーを活栓付きのプラスチックまたはガラスの柱に注ぎます。樹脂を重力下で沈殿させます。
4. 活栓を開き、カラム内の液面が樹脂のすぐ上になるまで、タンパク質溶液が重力流によってカラム内を通過できるようにします。精製されたHP-NAPを含む非結合画分としてフロースルーを収集します。
5. 15 ml の氷冷 20 mM Tris-HCl、pH 8.0、50 mM NaCl をカラムに加えます。
6. 活栓を開き、カラム内の液面が樹脂のすぐ上になるまで、洗浄バッファーが重力流によってカラム内を通過できるようにします。フロースルーを洗浄率として収集します。
7. プロトコルのステップ3.5から3.6をさらに4回繰り返して、追加の洗浄画分を収集します。

材料