Streptococcus mutansからのポリヒスチジンタグ付きタンパク質の精製手順

要約

出典: Murata, T., et al. Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、 ミュータンス連鎖球菌から分泌されるポリヒスチジンタグ付きタンパク質を精製するための段階的な手順を示します。

プロトコル

1. 硫酸アンモニウム沈殿により培養上清からタンパク質を濃縮します。
   手記： 標的タンパク質が細胞内にある場合は細胞体から抽出します。
   1. 細菌培養物(Streptococcus mutans)懸濁液を4°Cで10,000 x g で20分間遠心分離します。培養上清を3 Lガラスビーカーに回収します。
   2. 1,122 gの硫酸アンモニウムを2 Lの上清(80%飽和度)に加え、マグネチックスターラーを使用して激しく攪拌します。沈殿物を攪拌しながら4°Cで4時間以上形成します。
      手記： 沈殿物の形成は一晩続けることができます。
   3. 硫酸アンモニウム沈殿溶液を15,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。上清をデカントします。
   4. へらで沈殿物を集め、200 mLのガラスビーカーに移します。ペレットを35 mLの結合バッファー(50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、5 mMイミダゾール、pH 8.0)に再懸濁します。
   5. 再生セルロース透析チューブを使用して、4°Cで攪拌しながら、2,500 mLの結合バッファーに対して懸濁液を透析します。2時間後に透析液を交換し、一晩透析を続けます。
   6. 透析液を再度交換してください。さらに2時間透析を続けます。
2. 透析懸濁液を20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。吸引ろ過装置を使用してメンブレンフィルターを通して上清をろ過します。濾液を75 cm² フラスコに移します。
3. 固定化メタルアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)により、ろ過懸濁液からポリヒスチジンタグ付きグルコシルトランスフェラーゼ-SI(GTF-SI)を分画します。
   1. 2 mLのNi帯電したIMAC樹脂スラリー(約1 mLの樹脂)を、出口がシリコンチューブに取り付けられたクロマトグラフィーカラムに移します。重力流によって貯蔵液を取り除きます。
      注意： IMAC全体で樹脂が乾燥しないようにしてください。
   2. 蒸留水3mLをカラムに加え、樹脂を洗浄します。5 mLの結合バッファーを加えて樹脂を平衡化します。
   3. ホフマンピンチコックで流れを遮断します。ステップ2でろ過した懸濁液を5mL加えてスラリーを作ります。
   4. 残りのろ過懸濁液にすべてのスラリーを加えます。混合物を4°Cで30分間穏やかに旋回させます。
   5. 混合物をカラムに戻します。重力流によって懸濁液を取り外します。IMAC樹脂を20 mLの結合バッファーで洗浄します。
      手記： その後のIMAC全体で、ホフマンピンチコックを使用して流量を約2 mL /分に調整します。
   6. 組換えGTF-SIを20 mLの溶出バッファー(50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、500 mMイミダゾール、pH 8.0)で溶出します。
      手記： ここでプロトコルを一時停止できます。溶出液は4°Cで保存してください。IMAC樹脂は再利用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
遠心限外ろ過ユニット	ザルトリウス	VS2032	バッファーの置換とタンパク質濃度
遠心機	クボタ	7780II
クロマトグラフィーカラム	バイオラッド	7321010	IMACの場合
透析用メンブレンクランプ	フィッシャーブランド	21-153-100
透析チューブ	一つになって	2-316-06
イミダゾール	和光	095-00015	結合バッファーおよび溶出バッファーの調製
孵卵器	日本医療・化学機器	LH-100-RDS型	温度設定:37°C
マイクロ遠心分離機	クボタ	3740
塩化ナトリム	和光	191-01665	結合バッファーと溶出バッファーの調製
リン酸二水素ナトリウム二水和物	和光	192-02815	結合バッファーと溶出バッファーの調製
水酸化ナトリウム	和光	198-13765	結合バッファーと溶出バッファーの調製
硫安	和光	015-06737	硫酸アンモニウム沈殿
Ni 帯電樹脂	バイオラッド	1560133	IMACの場合
メンブレンフィルター	メルク・ミリポア	JGWP04700	直径0.2μm