急速平衡透析法による結核病変からのカゼウムへの薬物結合の測定

要約

出典: Sarathy、JP 他。 結核病変における薬物浸透を予測する in vitro カゼウム結合試験 J. Vis. 経験。 (2017年)

このビデオは、急速平衡透析を使用して結核病変からのカゼウムへの薬物結合を測定するための in vitro アッセイを示しています。カゼウム懸濁液の調製、透析の実施、およびカゼウムへの薬物浸透を予測するための結合していない薬物画分の計算の手順の概要を説明します。

プロトコル

1. 急速平衡透析(RED)アッセイ

1. 試験化合物の500 μM溶液の6.5 μLを643.5 μLのホモジネートにスパイクして、5 μM(≤1%DMSO)の最終濃度とボルテックスを達成します。
2. RED インサートをベース プレートに配置します。各REDインサートのドナーチャンバー(赤いリング)に200 μLの薬物をスパイクしたマトリックスを加え、各レシーバーチャンバーに350 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えます。各試験化合物に3つのインサートを準備します(サンプルを3回)。粘着プレートシールでプレートをシールし、サーモミキサー上で37°Cで200 rpm(1 x g)で4時間インキュベートします。
3. インキュベーション後、ドナーチャンバーとレシーバーチャンバーの内容物を上下に2〜3回ピペッティングして穏やかに混合します。ドナーチャンバーからホモジネートの20 μLアリコートをピペットで取り出し、1.5 mLチューブ(1:1)で20 μLのクリーンPBSに加えます。同様に、レシーバーチャンバーから20 μLのPBSサンプルのアリコートをピペットで取り出し、20 μLのクリーンホモジネートに加えます(マトリックスマッチング)。
   手記： マトリックスマッチングにより、定量分析のために2つの別々の検量線(ホモジネートとPBS)を作成する必要がなくなります。ドナーチャンバーの内容物は、時間の経過とともに沈殿する可能性があります。アリコートを取り出す前に、ピペッティングで内容物を穏やかに混合します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Pierce RED デバイス再利用可能なベースプレート	フィッシャーサイエンティフィック	PI-89811
ピアス RED デバイス インサート、50/箱	フィッシャーサイエンティフィック	PI-89809
PIERCE REDインサート取り外しツール	フィッシャーサイエンティフィック	89812
粘着プレートシール	フィッシャーサイエンティフィック	08-408-240
PBS、pH 7.4、10x 500 mL (Gibco)	ライフテクノロジー	10010-049
DMSOの	シグマ	472301