細菌における抗生物質の持続性を研究するためのマイクロ流体タイムラプス顕微鏡

Abstract

出典: Oms、T.、 et al。大 腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析 J. Vis. 経験。(2023年)

このビデオでは、マイクロ流体システム内で蛍光標識されたDNA結合タンパク質を発現する個々の細菌細胞をモニタリングするためのプロトコルを紹介します。これは、抗生物質がほとんどの細胞をどのように阻害するかを示しており、持続性細胞の亜集団は治療を生き延び、抗生物質の除去後に再成長します。

Protocol

マイクロ流体タイムラプス顕微鏡イメージング

手記： 次のセクションでは、マイクロ流体プレートの準備、およびタイムラプス画像取得および画像解析の手順について説明します。この実験の目的は、抗生物質治療時の持続性表現型を単一細胞レベルで観察および分析することです。この実験中に収集されたデータは、対処された質問および/または実験中に使用された蛍光レポーターに応じて、幅広い結果を生成するために使用できます。ここで説明する実験では、持続性細胞と非持続性細胞の核様体構成を反映した細胞長とHU-mCherry蛍光の定量分析が行われました。

1. マイクロ流体タイムラプス顕微鏡のための細菌細胞培養
   1. 5 mLの培地(3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸(MOPS)グリセロール0.4%、必要に応じて選択的抗生物質を添加)をガラス管(≥25 mL)に単離コロニーに接種し、チューブを37°Cおよび180 rpmに設定した振とうインキュベーターに一晩(15時間から19時間の間)置きます。
   2. 翌日、OD₆₀₀ nmを測定し、ガラス管内の新鮮な温度調整培地(37°C、MOPSグリセロール0.4%)で培養物を~0.001の最終OD₆₀₀ nmに希釈します。培養物を37°Cおよび180rpmの振とうインキュベーターで一晩(15時間から19時間の間)増殖させ、翌日に初期の指数期培養物を取得します。
2. マイクロ流体プレートの調製とタイムラプス顕微鏡イメージング
   手記： マイクロ流体実験は、市販のマイクロ流体デバイス(ここで説明されているように)または社内で製造されたマイクロ流体システムで実行できます。
   1. マイクロ流体プレートのすべてのウェルから保存溶液(存在する場合)を取り出し、新鮮な培地と交換します。
      手記： マイクロ流体プレートに排泄口ウェルが含まれている場合は、排出口ウェルの保存溶液を取り除く必要がありますが、培地に置き換えないでください。
   2. [ シール] ボタンをクリックするか、マイクロ流体ソフトウェアを使用して、マイクロ流体プレートをマニホールドシステムでシールします(最初に [ツール]を選択し、次に [シールプレート]を選択します)。
      手記： プレートをシールするには、プレートをマニホールドに手動で押し付けて、プレートとマニホールドに均一な圧力を加える必要があります。正しく実行されれば、ONIX2 インターフェイスに「sealed」というメモが表示されます。スライドガラスに圧力をかけないことは、マニホールドが破損する危険を避けるためである。.
   3. 密封したら、最初のプライミングシーケンスを実行します(マイクロ流体ソフトウェアインターフェイスの[ 液体プライミングシーケンスの実行 ]をクリックします)。
      注:液体プライミングシーケンスの実行 は、ウェル1〜5の6.9 kPaでの5分間の灌流、続いてウェル8の6.9 kPaでの5分間の灌流、およびウェル6の6.9 kPaで5分間の最終灌流ラウンドに対応します。 Run Liquid Priming Sequence は、異なるウェルを接続するチャネルにまだ存在する可能性のある保存溶液を除去することができます。
   4. 顕微鏡イメージングを開始する前に、顕微鏡のサーモスタット制御キャビネット内で、所望の温度(ここでは37°C)でプレートを最低2時間インキュベートします。
   5. 実験を開始する前に、2 回目の 液体プライミングシーケンスの実行 を開始します。
   6. マイクロ流体ソフトウェアインターフェイスの[シールオフ]をクリックして、マイクロ流体プレートをシールします。ウェル1およびウェル2の培地を200 μLの新鮮培地で、ウェル3の培地を抗生物質を含む200 μLの新鮮培地(ここでは、5 μg・^mL-1のオフロキサシン(OFX))に交換し、ウェル4およびウェル5を200 μLの新鮮培地で、ウェル6を200 μLの新鮮培地で交換します。 ウェル8では、200 μLの培養サンプル(ステップ1.2から)を新鮮な培地でOD₆₀₀ nm 0.01に希釈しました。
   7. 手順2.2で説明したようにマイクロ流体プレートを密封し、顕微鏡キャビネット内の顕微鏡対物レンズに置きます。
      手記： マイクロ流体プレートを配置する前に、顕微鏡の対物レンズに浸漬油を一滴垂らしてください。
   8. マイクロ流体ソフトウェアで、[ セルローディング] をクリックして、マイクロ流体プレートへのセルローディングを許可します。
      手記： セルローディングステップは、ウェル8の13.8 kPaでの15秒の灌流、続いてウェル6およびウェル8の27.6 kPaでの15秒の灌流、およびウェル6の6.9 kPaで30秒間の最終灌流ラウンドで構成されます。マイクロ流体プレート内の細胞の密度は、実験にとって重要です。このマイクロ流体プロトコルの最初の部分は、抗生物質治療の前に新鮮な培地で6時間細菌を増殖させることで構成されます。6時間の増殖後、細胞密度はまれな持続性細胞を検出するのに十分でなければなりません(この研究で使用された条件では、持続性細胞は10^〜4の頻度で生成されます)。細胞密度が高すぎると、個々の細胞を区別することが困難になり、正確な単一細胞分析ができません。増殖速度は培地に直接依存するため、実験を開始する前に顕微鏡視野内の細胞密度を評価する必要があります。
   9. 透過光モードを使用して最適な焦点を設定し、適切なセル数が観察されるいくつかの関心領域(ROI)を選択します(フィールドあたり最大300セル)。
      手記： 少なくとも40個のROIを選択して、希少な持続性細胞が画像化されるようにします。
   10. マイクロ流体ソフトウェアで、[ プロトコルの作成]をクリックします。新鮮な培地を6.9 kPaで6時間(ウェル1〜2)注入し、続いて抗生物質を含む培地を6.9 kPaで6時間注入し(ウェル3)、最後に新鮮な培地を6.9 kPaで20時間注入します(ウェル4〜5)。
       手記： OD₆₀₀ nm の 0.01 に希釈した細菌培養により、細菌はマイクロ流体チャンバー内で 6 時間増殖し、細胞が指数関数的成長段階にあることが保証されます。ローディングステップ(ステップ2.8を参照)中にマイクロ流体デバイスに導入された細胞の数に応じて、成長期の持続時間を調整して、ROIあたり最大300個の細胞を得ることができます。持続性はまれな現象であるため、ROIあたりの細胞数を増やすと、持続性細胞を観察できる可能性が向上します。ただし、セル数は、単一セル分析が面倒になるため、ROIあたり300セルを超えないようにしてください。
   11. 透過光と蛍光レポーターの励起光源を使用して、15分ごとに1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを実行します。ここでは、mCherry信号用の560nm励起光源を使用しました(フィルター00[530-585 ex、615LP em、Zeiss]を使用した10%出力の580nm LED、mCherryの場合は100msの露光)。Zeiss互換のZen3.2ソフトウェアを細胞イメージングに使用しました。
3. 画像解析
   手記： 顕微鏡画像の開封と視覚化は、オープンソースのImageJ/Fijiソフトウェア(https://fiji.sc/)を使用して実行されます。定量的画像解析は、オープンソースのImageJ/Fijiソフトウェアと無料のMicrobeJプラグイン(https://microbej.com)を使用して実行されます。このプロトコルでは、MicrobeJ 5.13I(14)バージョンが使用されました。
   1. コンピューターでImageJ / Fijiソフトウェアを開き、ハイパースタックタイムラプス顕微鏡画像をフィジーロードバーにドラッグします。 イメージ > カラー > コンポジットの作成 を使用して、ハイパースタックの異なるチャネルを融合します。タイムラプス実験のチャンネルが目的の色に対応していない場合(たとえば、位相差が灰色ではなく赤で表示されるなど)は、[ 画像]>[色]>[チャンネルの配置 ]を使用して、チャンネルに適切な色を適用します。
   2. MicrobeJプラグインを開き、手動編集インターフェースを使用して細菌細胞を検出します。自動的に検出されたセルを削除し、目的の永続セルをフレームごとに手動でアウトライン化します。
      手記： さまざまな設定を使用して、個々のセルを自動的に検出できます。分析されたパーシスター細胞は長いフィラメントを形成し、自動検出を使用して正しく検出されることはめったにないため、ここでは手動検出が使用されました。
   3. 検出後、MicrobeJ手動編集インターフェイスの [結果] アイコンを使用して、ResultJテーブルを生成します。ResultJファイルを保存し、それを使用して、単一細胞解析で関心のあるさまざまなパラメーターに関する洞察を得ることができます。このプロトコルでは、HU-mCherry強度の平均蛍光、細胞長、および個々の細胞の細胞面積がエクスポートされました。

Materials