蛍光レポータータンパク質を発現する細菌を用いた環状di-GMPモジュレーターのスクリーニング

要約

出典: Rugjee, K. N., et al.緑 膿菌におけるc‐ジ‐GMPシグナル伝達を調節する小分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立 J. Vis. 経験。 (2016)。

このビデオでは、c-di-GMP感受性プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する遺伝子組み換え細菌を使用した環状di-GMPモジュレーターのスクリーニングを示します。蛍光は、異なる試験化合物を含むマルチウェルプレートで測定されます。c-di-GMP産生を阻害する化合物は、蛍光の低下につながります。次に、データを分析して、細菌におけるc-di-GMPシグナル伝達の潜在的なモジュレーターを特定します。

プロトコル

1. 緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き環状di-GMP(c-di-GMP)レポーター緑膿菌株の生成

1. 5mlの溶原性ブロス(LB)培地に緑 膿菌 の単一コロニーを接種し、200 rpmで振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。
2. 2 mlの一晩培養物を1 Lフラスコ内の200 mlの新鮮なLB培地に移し、200 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。
3. フラスコから1mlのサンプルを採取し、分光光度計を使用して調べることにより、30分ごとに600 nm(OD₆₀₀)の光学密度を監視します。
4. OD₆₀₀ が0.3〜0.5に達したら、40mlの培養物を50mlの円錐形遠心分離管に入れます。
5. 4°Cで8,000rpmで10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄し、40mlの氷冷滅菌300mMスクロース溶液に細胞を再懸濁します。
6. ステップ1.5で説明したように遠心分離して細胞を2回ペレット化し、20mlの氷冷滅菌300mMスクロース溶液に再懸濁します。
7. ステップ1.5で説明したように遠心分離して細胞を最後にペレット化し、400 μlの氷冷滅菌300 mMスクロース溶液に再懸濁します。
   注:この時点での細胞密度は、約1 x 10¹¹ コロニー形成単位/ミリリットル(CFU/ml)である必要があります。
8. 細胞を氷上で30分間冷やした後、エレクトロポレーションの準備が整います。
9. 1 μlの0.2 μg/μl pCdrA::gfp^C プラスミド溶液を、氷上で予冷した1.5 mlの微量遠心チューブで上記で調製した 緑膿菌 エレクトロコンピテント細胞40 μlに加えます。懸濁液を混合し、事前に冷却した2 mmの電極ギャップ、エレクトロポレーションキュベットに移します。
10. ティッシュペーパーでキュベットの外側の水分を取り除き、キュベットをエレクトロポレーターのサンプルチャンバーに入れます。電圧2.5kV、静電容量25μF、抵抗200 Ωのパルス。
11. キュベットを取り出し、1mlのLB培地を加えます。次に、細胞を滅菌1.5ml微量遠心チューブに移し、200 rpmで振とうしながら37°Cで2時間インキュベートします。
12. 培養物の10 μl、50 μl、および100 μlのアリコートを、アンピシリン(濃度100 μg / ml)を添加した滅菌LB-寒天プレートに広げ、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
13. 標準的なGFPチャネルで蛍光顕微鏡下でプレートを調べてGFP発現(485 nmでの励起、520 nmでの発光)を確認し、1つのコロニーを選択して5 mL LBを接種します。ステップ1.1で説明したように一晩インキュベートします。0.5 mlの一晩培養物と0.5 mlの50%グリセロールを2 mlのスクリュートップチューブに混合し、-80°Cで保存します。

2. 接種用スターター培養物の調製

1. スクリーニングの2日前に、緑 膿菌 株(pCdrA::gfp^C プラスミドを含む)を-80°CストックからLB寒天プレート(濃度100μg/mlのアンピシリンを添加)にプレートし、無菌接種ループを使用してプレート上に穏やかに広げます。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
2. スクリーニングの前夜に、プレートから緑 膿菌 の単一コロニーをチューブ内の10mlのLB培地(濃度100μg/mlのアンピシリンを添加)に接種し、200rpmで振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。
3. スクリーニング当日に、最初に新鮮なLB培地でOD₆₀₀ 1.0に希釈し、次に5%LBで希釈してOD₆₀₀ 0.04(1:25比)にすることにより、一晩の前培養から継代培養を調製します。
   注:接種培地の総量は、テストするプレートの数によって異なります。5%LBは、100%LBをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で必要な濃度に希釈することによって作られます。重要なことに、培地(5%LB)は、緑膿菌におけるpCdrA::gfp^Cの構成的活性化を可能にします。
4. 滅菌マグネチックスターラーバーを容器に加え、室温で30分間マグネチックスターラーで最小速度で培養物を撹拌し、細菌が培地に順応してから384ウェルプレートに分注できるようにします。

3. 低分子を含む384ウェルプレートの接種とインキュベーション

注:無菌性と優れた無菌技術は、次の手順で最も重要です。

1. ポジティブコントロール(100%阻害)を調製するには、ステップ2.3で調製した継代培養物の10 ml(最大12プレートに十分)に20 μlの硫酸トブラマイシン(25 mg / ml)を加え、穏やかに混合します。40 μlのポジティブコントロール培養物をウェルA23-P23にピペットで入れます(図1)。
2. ネガティブコントロール(0%阻害)を調製するには、ステップ2.3で調製した継代培養物10ml(最大12プレートに十分)に30μlのジメチルスルホキシド(DMSO)を加え、穏やかに混合します。40 μlの陰性対照培養物をウェルA24-P24にピペットで入れます(図1)。
3. 小分子でスタンプされた各プレートについて、40 μlの希釈した一晩培養物(ステップ2.3で説明)をウェルA1-P22に接種します(図1)。
   注:これは、リキッドハンドラーロボットを使用して実現できます。細菌培養物は不均一な特性を持っているため、分注中に細菌を培地内に一貫して分布させるために、継続的かつ適度な撹拌を維持することが重要です。これを行うには、分注中にステップ2.4から順応した培養物を磁気的に撹拌し続けます。
4. プレートを通気性カバーシールで密封し、37°Cで6時間インキュベートします。
   注:通気性シールは、384ウェルすべてで不変の状態を維持し、プレート全体の酸素勾配の潜在的な発生を回避するために重要です。

4. 成長(OD600)および細胞内c-di-GMPレベル(GFP)の測定

1. 分光光度測定の約30分前に、結露を避けるためにプレートリーダーを37°Cに予熱します。
2. 読み取る前に、通気性のあるカバーシールをそっと取り外してください。600 nmの波長で、ウェルあたり10回のフラッシュと0.2秒のセトリング時間の設定で光学密度を測定します。
3. 蛍光を測定する前に、ウェルA24(ネガティブコントロール)に基づいてゲインと焦点の自動調整を行い、ゲイン目標値を75%に設定します(図1)。
   1. プレートリーダー制御ソフトウェアから、測定開始をクリックし、「フォーカスとゲインの調整/プレートID」タブをクリックします。
   2. ウィンドウの右側にある「ピント調整」と「チャンネルA」を選択します。
   3. 「ゲイン調整」と「よく選択」を選択し、「目標値」として「75」と入力します。最後に、「調整開始」をクリックする前に、プレートレイアウトでA24をよく選択します。調整が完了したら、「測定開始」をクリックします。
   4. GFPレポーターからの蛍光を、485/520 nmの励起/発光最大値で、ウェルあたり10回のフラッシュと0.2秒のセトリング時間で測定します。
4. 検査したすべてのプレートからデータを収集します。
   注:データの読み取り値は、プレートリーダー制御ソフトウェアによってデフォルトとして自動的に保存されます。
   1. 制御ソフトウェア内の「火星」アイコンをクリックして測定値を表示し、統計分析パッケージを開きます。
   2. 対象のプレート番号を「ダブルクリック」してデータを取得し、分析用のデータにアクセスします。

結果

図 1.低分子スクリーニングアッセイに用いる384ウェルプレートマップ ライブラリーからの化合物(水色)はウェルA1-P22に分注されます。最終濃度50μg/mlのトブラマイシン硫酸からなる「ポジティブコントロール」(赤)をウェルA23-P23に添加し、最終濃度1%DMSOを含む「ネガティブコントロール」(緑)をウェルA24-P24に追加します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
溶原性ブロス(レノックス)	シグマ・アルドリッチ	L3022-1KG
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S0389-1KG
寒天と溶原性ブロス(レノックス)	シグマ・アルドリッチ	L2897-1KG
アンピシリンナトリウム	シグマ・アルドリッチ	A0166-25G
グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G5516-1L
リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4	ライフテクノロジー	10010-056
硫酸トブラマイシン	シグマ・アルドリッチ	T1783-100MG
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	276855-250MLです
ジェネシス 10S 紫外可視分光光度計	サーモサイエンティフィック	840-208100
2mmギャップエレクトロポレーターキュベット	バイオラッド	1652092
BioRad GenePulser XCellエレクトロポレーター	バイオラッド	1652662
ライカ蛍光実体顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	MZ16FAシリーズ
ブランド磁気撹拌バー、PTFE、ピボットリング付き円筒形(使用前にオートクレーブ滅菌で滅菌)	シグマ・アルドリッチ	Z328952-10EA
384ウェル、白壁、クリアボトムプレート	グライナー	781098
マルチドロップコンビ試薬ディスペンサー	サーモサイエンティフィック	5840300
マルチドロップコンビチューブ	サーモサイエンティフィック	24073290
VIAFLO II 16チャンネル電動ピペット	インテグラ・バイオサイエンス	4642
100ml滅菌使い捨て試薬リザーバー	フィッシャーサイエンティフィック	12399175
AeraSeal通気性メンブレン	シグマ・アルドリッチ	MKBQ1886
Pherastarプレートリーダー(ソフトウェアバージョン:4.00 R4、ファームウェアバージョン:1.13)	BMGラボテック	フェラスターFS