モノクローナル細菌培養物を調製する技術

要約

出典: Lin、P.、 et al. 細菌の鉱物排泄によるタングステン酸ナトリウムとモリブデン酸ナトリウムのマイクロカプセルの合成 J. Vis. 経験。 (2018)。

このビデオは、寒天プレート上での連続希釈とコロニー単離によるミネラル生産のためのモノクローナル細菌培養物の調製を示しています。プレートをガラスビーズで振ることにより、個々の細胞が空間的に分離され、遺伝的に均一なコロニーが形成され、その後、増殖のために液体培地に移されます。濁度が最も高い培養物が選択され、最も密度の高いモノクローナル集団と鉱物生産の可能性が最も大きいことを示します。

プロトコル

1. ガラスビーズの調製

1. 直径3 mmのガラスビーズ100個を100 mLの実験用ボトルに入れ、しっかりとキャップをします。
2. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。
3. ボトルを室温まで冷ましてから、バイオセーフティキャビネットに入れます。

2. 溶原性ブロス(LB)の調製

1. LB-Lennoxブロスの粉末8 gを500 mLの実験用ボトルに400 mLの水で溶かします。
2. ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)磁気撹拌棒で内容物を20分間撹拌し、しっかりとキャップを閉めます。
3. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。
4. 溶液を室温まで冷ましてから、バイオセーフティキャビネットに入れます。
5. ピペットを使用して、ブロスをバイオセーフティキャビネット内の8本の15 mL遠心分離管(各12.5 mL)に分注します。
6. 残りのブロスをバイオセーフティキャビネット内の3本の100 mLラボボトル(各100 mL)に分注します。3本のボトルにしっかりと蓋をします。バイオセーフティキャビネットに保管してください。

3. シワネラ藻類の培養

1. 急速冷凍凍結保存株を使用してください。
2. バイオセーフティキャビネットで、冷凍チューブから1mLの凍結材料をステンレス鋼のヘラで取り出し、ステップ3.5で準備した遠心分離管に入れます。
3. 培養物を37°Cのインキュベーターで24時間インキュベートします。

4. LB-Lennox(寒天入りブロス)ペトリ皿の調製

1. LB-Lennox(寒天入りブロス)を2錠を100mLの水を入れた100mLのラボボトルに溶かします。
2. PTFE磁気攪拌棒で内容物を20分間かき混ぜてから、しっかりとキャップをします。
3. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。
4. バイオセーフティキャビネットで、100 mLの溶液を4つのペトリ皿に手で分注し、それぞれが~25 mLを受け取るようにします。溶液を室温まで冷ましておきます。

5. モノクローナル細菌の調製

1. バイオセーフティキャビネットで、ステップ2.6、#1、#2、#3で準備した3本のボトルにそれぞれラベルを付けます。
2. ステップ3.3で得られた細菌懸濁液0.1 mLをボトル#1にピペットで入れます。ボトルに蓋をし、手で1分間振り回して均一な溶液を作ります。
3. ステップ5.2で得られた細菌液0.1 mLをボトル#2にピペットで入れます。ボトルに蓋をし、手で1分間振り回して均一な溶液を作ります。
4. ステップ5.3で得られた細菌液0.1 mLをボトル#3にピペットで入れます。ボトルに蓋をし、手で1分間振って均一な溶液を作ります。
5. ボトル#3の液体を、ステップ4.4で調製した4つのペトリ皿に、それぞれ0.02 mLの容量を使用してピペットで入れます。
6. 手順1.3で準備したガラスビーズを、使用した4つのペトリ皿に入れ、各皿に4つのビーズを入れます。
7. ペトリ皿の蓋を閉め、手で1分間振ってください。
8. ペトリ皿を逆さまにし、37°Cのインキュベーターで24時間インキュベートします。

6. モノクローナル細菌の増殖

1. 手順2.5で準備したチューブを7本取得します。
2. ステップ5.8で準備した4つのペトリ皿から得られたモノクローナル細菌をステンレス鋼スパチュラで選び出し、別々に7つのチューブに入れます。
3. 7本のチューブを37°Cのインキュベーターに24時間放置します。
4. 視覚比色法を使用して、光散乱が最も大きいものを選択します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天錠入りLB(レノックスブロス)	シグマ・アルドリッチ	L7075	寒天入り50mLブロスに1錠
LB(レノックスブロス)	シグマ・アルドリッチ	L3022-1KG	LB(レノックス)パウダー1kg
無水ブドウ糖	日本Shiyaku試薬	PL78695	グルコース
50 mL遠心分離管	隼	14-432-22
15 mL遠心分離管	隼	14-959-53A
実験用ボトル 100 mL	デュラン	21 801 24 5
実験用ボトル 500 mL	デュラン	21 801 44 5
ステンレススチール製スパチュラ	ケムグラス	CG-1981-10
PTFE使い捨て撹拌棒	漁夫	S68066
プラスチック製ペトリ皿	漁夫	S33580A
孵卵器	お客様作り	オーダーメイド	40°Cに加熱するか、18°Cまで冷却し、時間調整
バイオセーフティキャビネット	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	バクテリア関連のプロセスはすべてここで行われます
オートクレーブ	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., 台北市, 台湾, ROC	TM-329	120°Cに10分間加熱します