金属還元菌を用いた金属酸化物マイクロカプセルの合成

要約

出典: Lin、P.、 et al.細菌の鉱物排泄によるタングステン酸ナトリウムとモリブデン酸ナトリウムのマイクロカプセルの合成J. Vis. Exp. (2018)。

このビデオでは、金属還元細菌を金属イオンで培養し、超音波処理、遠心分離、およびエタノール洗浄による順次精製によって硬質金属酸化物マイクロカプセルを合成する手順を示します。

プロトコル

注意: 実験を行うには、ラテックス手袋、保護眼鏡、白衣を使用してください。バイオセーフティキャビネットを使用するときは、キャビネットファンをオンにし、キャビネットのドアを半分閉じたままにしてください。

1. ガラスビーズの調製

1. 直径3 mmのガラスビーズ100個を100 mLの実験用ボトルに入れ、しっかりとキャップをします。
2. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。
3. ボトルを室温まで冷ましてから、バイオセーフティキャビネットに入れます。

2. 溶原性ブロス(LB)の調製

1. LB-Lennoxブロスの粉末8 gを500 mLの実験用ボトルに400 mLの水で溶かします。
2. PTFE(ポリテトラフルオロエチレン)磁気撹拌棒で内容物を20分間撹拌し、しっかりとキャップを閉めます。
3. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。
4. 溶液を室温まで冷ましてから、バイオセーフティキャビネットに入れます。
5. ピペットを使用して、ブロスをバイオセーフティキャビネット内の8本の15 mL遠心分離管(各12.5 mL)に分注します。
6. 残りのブロスをバイオセーフティキャビネット内の3本の100 mLラボボトル(各100 mL)に分注します。3本のボトルにしっかりと蓋をし、バイオセーフティキャビネットに保管してください。

3. シワネラ藻類の培養

1. 急速冷凍凍結保存株を使用してください。
2. バイオセーフティキャビネットで、冷凍チューブから1mLの凍結材料をステンレス鋼のヘラで取り出し、ステップ3.5で準備した遠心分離管に入れます。
3. 培養物を37°Cのインキュベーターで24時間インキュベートします。

4. LB-Lennox(寒天入りブロス)ペトリ皿の調製

1. LB-Lennox(寒天入りブロス)を2錠を100mLの水を入れた100mLのラボボトルに溶かします。
2. PTFE磁気攪拌棒で内容物を20分間かき混ぜてから、しっかりとキャップをします。
3. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。
4. バイオセーフティキャビネットで、100 mLの溶液を4つのペトリ皿に手でアリコートし、それぞれが~25 mLを受け取るようにします。溶液を室温まで冷ましておきます。

5. モノクローナル細菌の調製

1. バイオセーフティキャビネットで、ステップ2.6、#1、#2、#3で準備した3本のボトルにそれぞれラベルを付けます。
2. ステップ3.3で得られた細菌懸濁液0.1 mLをボトル#1にピペットで入れます。ボトルに蓋をし、手で1分間振り回して均一な溶液を作ります。
3. ステップ5.2で得られた細菌液0.1 mLをボトル#2にピペットで入れます。ボトルに蓋をし、手で1分間振り回して均一な溶液を作ります。
4. ステップ5.3で得られた細菌液0.1 mLをボトル#3にピペットで入れます。ボトルに蓋をし、手で1分間振って均一な溶液を作ります。
5. ボトル#3の液体を、ステップ4.4で調製した4つのペトリ皿に、それぞれ0.02 mLの容量を使用してピペットで入れます。
6. 手順1.3で準備したガラスビーズを、使用した4つのペトリ皿に入れ、各皿に4つのビーズを入れます。
7. ペトリ皿の蓋を閉め、手で1分間振ってください。
8. ペトリ皿を逆さまにし、37°Cのインキュベーターで24時間インキュベートします。

6. モノクローナル細菌の増殖

1. 手順2.5で準備したチューブを7本取得します。
2. ステップ5.8で準備した4つのペトリ皿から得られたモノクローナル細菌をステンレス鋼スパチュラで選び出し、別々に7つのチューブに入れます。
3. 7本のチューブを37°Cのインキュベーターに24時間放置します。
4. 視覚比色法を使用して、光散乱が最も大きいものを選択します。

7. ブドウ糖と塩を使ったLB-Lennoxブロスの調製

1. 10 gのLB-Lennoxブロス、10 gのNaCl、および10 gのグルコースを500 mLの実験用ボトルに入れます。容量が450mLに達するまで水を加えます。
2. PTFE磁気攪拌棒で内容物を20分間攪拌します。
3. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。

8. タングステン酸ナトリウムの調製

1. 16.5 gのタングステン酸ナトリウムNa₂WO 4.2H ₂Oをステンレス鋼のヘラで100 mLの実験用ボトルに入れます。容量が50mLに達するまで水を加えます。
2. PTFE磁気攪拌棒で内容物を20分間攪拌します。
3. 内容物を120°Cで10分間オートクレーブします。
4. バイオセーフティキャビネットでは、1μmの細孔を持つ真空グラスファイバーフィルターを介して濾液を取得します。

9. グルコース、塩、タングステン酸ナトリウムによるLBの調製

1. バイオセーフティキャビネットで、ステップ8.4で得られた濾液を、ステップ7.3で調製したブドウ糖と塩を含む溶液に手で注ぎます。
2. バイオセーフティキャビネットで、ステップ9.1で得られた500 mLの溶液をピペットで10 x 50 mLの遠心分離管に分注します。

10. 細菌の培養

1. バイオセーフティキャビネットで、ステップ6.4で調製した液体をフェッチし、ピペットでステップ9.2で調製した10本の試験管に分注し、各チューブに0.05 mLを投与します。
2. 10本のチューブを37°Cのインキュベーターで120時間インキュベートします。

11. BMEミネラルの収穫

1. ステップ9.2の10本のチューブのそれぞれを20KHzで150 Wで1時間超音波処理します。
2. チューブを2,025 x g で1時間遠心分離します。
3. ピペットでチューブ内の透明な液体を取り除き、水を加えてから、手順11.1と11.2をもう一度繰り返します。
4. ピペットでチューブ内の透明な液体を取り除き、アルコールを加え、20 KHzで150 Wで1時間超音波処理します。
5. チューブを2,025 x g で1時間遠心分離します。
6. 手順 11.4 と 11.5 をもう一度繰り返します
7. ピペットでチューブ内の透明な液体を除去することにより、BMEミネラルを収穫します。その後、乾燥プロセスを実行せずにすぐにチューブにキャップをします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天錠入りLB(Lennox)ブロス	シグマ・アルドリッチ	L7075	寒天入り50mLブロスに1錠
LB(レノックス)ブロス	シグマ・アルドリッチ	L3022-1KG	LB(レノックス)パウダー1kg
無水ブドウ糖	日本Shiyaku試薬	PL78695	グルコース
タングステン酸ナトリウム	日本Shiyaku試薬	PL76050	Na2WO4 · 2H2O
塩化ナトリウム	日本Shiyaku試薬	PL68131	NaCl
エタノール 99.5%	アクロスオーガニック	AC615090040	CH3CH2OH
水	本学製		脱イオン水
オートクレーブ	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., 台北市, 台湾, ROC	TM-329	120°Cに10分間加熱します
遠心機	Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC	DSC302SD	2025 x g の遠心分離機
-80°C冷蔵庫	パナソニック	MDF-U3386S	凍結保存株の急速凍結に使用
超音波ホモジナイザーソニケータープロセッサセルディスラプター	レノックス	UPS-150	周波数 20 KHz 電力 150 W
孵卵器	お客様作り	オーダーメイド	40°Cに加熱するか、18°Cまで冷却し、時間調整
相互振とう浴	キングテックサイエンティフィック株式会社	WBS-L
デジタル撹拌ホットプレート	コーニング	#6797-620D	PTFE磁気撹拌バーと併用
バイオセーフティキャビネット	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	バクテリア関連のプロセスはすべてここで行われます
50 mL遠心分離管	隼	14-432-22
15 mL遠心分離管	隼	14-959-53A
実験用ボトル 100 mL	デュラン	21 801 24 5
実験用ボトル 500 mL	デュラン	21 801 44 5
ステンレススチール製スパチュラ	ケムグラス	CG-1981-10
PTFE使い捨て撹拌棒	漁夫	S68066
プラスチック製ペトリ皿	漁夫	S33580A
シェワネラ藻類	著者 #3 の礼儀	著者 #3 の礼儀