熱ストレスラットの腸内微生物転座に対する有益菌の影響の評価

要約

出典: Sorokulova、I.、 et al。 Bacillus subtilis 株によるラットにおける熱ストレス悪影響の予防 J. Vis. 経験。 (2016年)

このビデオは、有益な細菌またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で前処理され、熱ストレスにさらされて腸のバリアの完全性を評価するラットを示しています。対照ラットの多数のコロニーとは対照的に、治療されたラットの肝臓からの腸由来細菌コロニーが少ないことは、無傷の上皮バリアと最小限の細菌転座を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 実験計画

1. 順応の2日後、経口強制経口による動物の治療を開始します。経口強制検口針で注射器を使用してください。16匹のラットを枯草菌BSB3懸濁液(ラット1匹あたり1ml)で1日2回、2日間処理します(枯草菌群)。16匹のラットをリン酸緩衝生理食塩水PBS(ラット1匹あたり1ml)で1日2回、2日間処理します(PBS群)(図1)。
2. 治療後、各グループ(グループあたり8匹のラット)を細分化します:グループ1-対照(PBS/ストレスなし)、グループ2-枯草菌 (枯草 菌/ストレスなし)、グループ3ストレス(PBS/熱ストレス)、およびグループ4- 枯草菌 +ストレス(枯草菌/熱ストレス)。
3. 電子デジタル体温計を使用して各ラットの直腸温度を測定します。グループ1および2のラットを室温で25分間保持します。グループ3および4の動物を、45°C、相対湿度55%の気候チャンバーに25分間置きます。
4. その後、電子デジタル体温計を使用して、すべてのグループの各ラットの直腸温度を測定します。すべての動物を室温で4時間置きます。
5. 密封可能な麻酔ジャー内のイソフルラン(2〜4%)でラットを麻酔し、ラットが深く麻酔されるまで観察します(つま先のつまみに対する反応がない)。ギロチンによる迅速な斬首によってラットを安楽死させます。
6. 各ラットから体幹の血液(15〜16 ml)を無発熱性ピペットで無発熱性チューブに採取して血清を採取し、直ちにピペットで血液サンプル(各ラットから7 μl)を採取して顕微鏡検査を行います。
7. 血液の入ったチューブを冷蔵庫に少なくとも30分間入れて、凝固させます。チューブを20°C、7,000 x g で10分間遠心分離し、ピペットで血清をすばやく除去します。各ラットから得られた血清を50μlの容量に分注し、アッセイまで-20°Cで保存します。

2. 外科的処置

1. 枝肉の下側の腹部と胸部からすべての毛皮を電動ハサミで切り取る/トリミングします。枝肉を滅菌キャビネットに入れ、枝肉の削った表面を70%アルコールで処理します。
2. 滅菌メスを使用して、腹部の正中線切開を作成します。滅菌ピンセットを使用して、各ラットから肝臓、腸間膜リンパ節、脾臓、小腸を除去します。

3. 細菌転座の解析

1. 肝臓、腸間膜リンパ節、脾臓の各サンプルを、事前に計量された滅菌チューブに入れ、計量します。サンプルの重量は、サンプルの入ったチューブの重量と空のチューブの重量の差として計算します。
2. 無菌PBSをチューブに添加して、サンプルの1:10希釈(体積あたりの重量、w / v)を取得し、滅菌ガラス組織ホモジナイザーで各サンプルを均質化して、均一な懸濁液を取得します。
3. 滅菌PBSで各サンプルを連続希釈(^10-1 〜^10-4)します。各組織のすべての希釈液の0.1 mlを、ヘミン(0.005 g / L)およびビタミンK1(0.01 g / L)プレートでMacConkey'sおよび5%血液寒天培地およびブルセラ血液寒天培地の表面にプレートします。
4. MacConkeyと5%血液寒天プレートを好気的にインキュベートし、ブルセラ血液寒天プレートを37 ^°Cの嫌気性条件下でインキュベートします。
5. コロニーカウンターを使用して、24時間後に好気性細菌のコロニーを数え、48時間後に嫌気性細菌のコロニーをインキュベーション後にカウントします。結果は、組織グラム中のコロニー形成単位(CFU)の数として表します。

結果

図 1.研究デザイン。ラットの2群(各群に16匹のラット)を、枯草菌BSB3(枯草菌群)またはPBS(PBS群)で1日2回経口強制投与した。3日目に、各グループを各グループで8匹のラットに細分しました。グループ3および4のラットを45°Cで25分間放置した。対照動物(グループ1および2)を室温で保管しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	P4417
エチルアルコール	Pharmco products Inc. 米国コネチカット州ブルックフィールド	64-17-5
寒天	VWRの	97064-334
MacConkey寒天プレート	VWRの	470180-742
5%血液寒天プレート	VWRの	89405-024
ヘミンとビタミンKを含むブルセラ血液寒天プレート	VWRの	89405-032
環境チャンバー 6020-1	キャロン、オハイオ州マリエッタ、米国	6020-1
遠心機	ベックマン・コールター、インディアナポリス、インディアナ州、米国	オプティマL-90K
コロニーカウンター	Fisher Scientific , ピッツバーグ, ペンシルベニア州, アメリカ合衆国	RE-3325
フリーザー	ハイアール、ブルックリン、ニューヨーク、アメリカ合衆国	HCMO50LA
ピペット	ギルソン、ピペットマン、フランス	P100、P200、P1000
シャーレ(100mm×15mm)	Fisher Scientific、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ	875713
SterilGard III アドバンス	The Baker Company、米国メイン州サンフォード	SG403
ティッシュホモジナイザー、Dounce	VWRの	71000-518