枯 草菌 胞子の生産とエアロゾルベースの沈着

要約

出典: Fuchs、FM、 et al.生細胞顕微鏡を用いた枯 草菌 胞子の生存に対する低圧プラズマ滅菌の有害な影響の調査 J. Vis. 経験。 (2017年)

このビデオでは、 枯草菌 胞子の生産、精製、エアロゾルベースの沈着をデモンストレーションし、均一な単層を作成し、胞子の発芽、生存率、ストレス応答の顕微鏡ベースの分析などの下流アプリケーションを可能にします。

プロトコル

1. 枯草菌 の胞子の生産と精製

1. 胞子産生のために、適切な抗生物質を添加したそれぞれの枯 草菌 株の5 mLの一晩培養物を200 mLの倍倍強度液体シェーファー胞子形成培地(1リットルあたり16 gの栄養ブロス、KCl(塩化カリウム)2 g、0.5 g MgSO₄ * 7 H₂O(硫酸マグネシウム七水和物)、2 mL 1 M Ca(NO₃)₂ (硝酸カルシウム)、 2 mL 0.1 M MnCl₂ *• 4 H₂O(塩化マンガン四水和物)、2 mL 1 mM FeSO₄ (硫酸第一鉄)、2 mL 50%(w / v)グルコース18)を37°Cで72時間、または培養物の95%>胞子形成するまで、激しく曝気して培養します。次の株の胞子が使用されます: 枯草菌 PY79 (野生型) 枯草菌 PY79ΔrecA::neo (DNA 修復タンパク質 RecA 欠損) 枯 草菌 PY79 recA-yfp::cat (黄色蛍光タンパク質 [YFP] と融合した RecA)。
2. 50 mLチューブで3,000 x g で15分間遠心分離して胞子を回収し、滅菌蒸留H₂Oを使用して洗浄ステップを繰り返し(最大15回)してサンプルを精製し、位相差顕微鏡で純度と発芽状態を確認します。胞子懸濁液が相光沢胞子(>99%)で構成され、栄養細胞(桿体)、発芽胞子(黒/灰色の外観)、および細胞破片がないことを確認します。そうしないと、さらなる顕微鏡実験が妨げられる可能性があります。所望の純度に達するまでサンプルを洗浄します。
3. LB (luria-bertani)-寒天培地に 50 μL の 10 倍連続希釈液をプレーティングすることにより、胞子力価を決定します (すなわち、1:10 希釈に 30 μL サンプル + 270 μL 滅菌水を使用します。特定の希釈液から30 μLを270 μL、H₂O、1:100希釈など)に取り、CFU(コロニー形成単位)を計算し、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。CFU測定後、濃縮または滅菌水で希釈することにより、サンプルを1mLあたり10⁹ 胞子に調整します。

2. エアロゾル沈着枯 草菌 胞子のサンプル調製

手記： 胞子の蓄積と重なりは、治療中に影効果を引き起こし、最終的には不活性化動態が改ざんされる可能性があります。この問題を最小限に抑えるには、エアロゾル沈着技術によって胞子サンプルを調製します。簡単に言えば、高精度の2物質ノズルを、加圧キャリアガスの流れ(ここではN₂)の流れと協調して液体スループットを調整する電気タイマーで制御します。注入された液体サンプルを窒素ガスの流れを利用してノズル出口から分散させます。

1. サンプルキャリアを、滅菌した顕微鏡スライド(生存動態用)または丸い25 mmカバーガラス(DNA修復プロセス/cLSMの蛍光追跡用、共焦点レーザー走査顕微鏡用)の形で、ノズルと一直線に並べて電動エアロゾルスプレーユニット内に配置します。使用される胞子濃度は、所望の最終濃度の100倍に対応する必要があります。
2. 胞子培養物1mLをノズル液入口に移し、1.3 barの圧力で0.1秒の噴霧プロセスを開始します。噴霧された胞子懸濁液(1 x 10⁷)は、顕微鏡スライド上に薄膜を形成し、数秒以内に急速に乾燥して均一に分布した胞子単層を形成します。処理したサンプルキャリアを滅菌容器に入れて室温で保管します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2物質ノズル(モデル970-8)	シュリック	14,404	230 V、50 Hz、D 4.484/8、ボア径0.8 mm
ルリア・ベルタニ・ミディアム	シグマ・アルドリッチ	70122-100G
チューブコネクタ	フェスト	該当なし	G 1/8
スライドガラス	VWRの	48300-026
Attofluorセルチャンバー	メンゼル、フィッシャー参照。	3406816	d=25 mm、円形
硫酸マグネシウム七水和物	シグマ・アルドリッチ	13152
硝酸カルシウム	シグマ・アルドリッチ	202967
塩化マンガン四水和物	シグマ・アルドリッチ	244589
硫酸第一鉄	アプリケム	13446-34-9
グルコース	メルク	215422
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P9541-500G
栄養ブロス(NB)	メルク	105443
ルリア・ベルターニ (LB)	メルク	110283
96ウェルプレート	サーモフィッシャー	243656