フローサイトメトリーを用いた Microcystis aeruginosa の生存率解析

要約

出典: Chapman, I. J., et al., Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a photosynthetic organism (Microcystis aeruginosa) using Flow Cytometry. J. Vis. 経験。 (2016年)

このビデオでは、蛍光プローブ標識と、フィコシアニン自家蛍光およびプローブシグナルのフローサイトメトリー分析を組み合わせることにより、生細胞と死細胞を区別する方法を示します。

プロトコル

1. 分子プローブ細胞取り込みの最適化

1. M . aeruginosa 培養物の半分を指数関数的な段階から収穫し、それを「生きた」コントロールとして使用します。
   注:高密度培養から指数関数的段階に直接希釈されたサンプルは、最初のラグ/誘導段階から接種された培養と比較して、死細胞代謝回転による最適化結果に影響を与える可能性があります。
2. 残りの半分は、70%エタノール、サンプルを60 ^°Cで1時間加熱、パラホルムアルデヒド、または4%ホルムアルデヒドを30分間加熱するなどの方法を使用して、「死んだ」コントロールとして調製します。サンプルの微小環境(pHなど)の変化を確認します。
   注:M .緑膿菌 の陽性、熱殺傷された「死んだ」コントロールは、フィコシアニンシグナルの減少によって「生きた」サンプルと区別されます。他の方法で死亡率を誘導しても、同じ出力が得られない可能性があり、種によって異なります。
3. 「ライブ」サンプルと「デッド」サンプルの異なる比率(例:0%、25%、50%、100%)を使用して混合サンプルを設定します。
4. ボルテックスまたは超音波処理によってコロニー形成を分解し、pHをチェックします。
5. 緑色(蛍光チャネル1またはFL1、530±15 nm)およびオレンジ色(蛍光チャネル2またはFL2、585±20 nm)の核酸プローブおよび640 nmレーザーからの蛍光を記録できる検出器と一緒に488 nmレーザーを選択して、それぞれの検出器を介してフィコシアニンシグナルを記録します。
   注:DNAに結合した場合、緑色の核酸プローブはおおよその蛍光励起波長が504 nm、発光最大値は523 nmですが、オレンジ色の核酸プローブは励起波長が547 nm、発光最大値は570 nmです。488 nmのアルゴンイオン固体レーザーを使用して両方の分子プローブを励起できますが、緑色レーザー(最大547 nm)はより高いオレンジ色の蛍光を生成します。
6. 出発点として、メーカーが推奨する濃度の分子プローブを50%の「生体」培養物と50%の「死体」培養物に導入し、暗所でインキュベートします。
7. 新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズ(FSC-Hまたは前方散乱高さ、80,000)を低減するスレッショルドとトリガーを使用して、サンプル導入ポート(SIP)の下にサンプルを配置します。
8. FSC-HおよびSSC-H(側方散乱高さ)パラメータと3つのヒストグラムを使用して密度プロットを作成します。それぞれの分子プローブ光学検出器チャネル(FL1または2)を使用したヒストグラム、フィコシアニン放出(蛍光チャネル4の高さまたはFL4-H)を検出するヒストグラム、およびFSC-Hをすべて対数スケールで検出します。
9. M . aeruginosa サンプルを核酸プローブとともに暗所で最大60分間インキュベートし、さまざまな時点で別々のデータセルに記録します(1、5、10、15、30、および60分)。
   注:pHなどのパラメータを調整するときは、特定の化学物質による潜在的な反応についてメーカーに確認してください(テストされた核酸プローブの場合、DNAとの結合が減少するため、バッファーにリン酸塩または高レベルの一価または二価のカチオンを含めることはできません)。
10. ソフトウェアゲートを適用して、それぞれの蛍光プローブチャネルヒストグラムに標的生物の細胞サイズのFSC-Hヒストグラム(320,000 - 1,500,000)のみを含めます。
    注:このプロトコルで使用された濃度は0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、および100μMであり、これは緑 膿菌 サンプルまたは核酸プローブの初期ストック溶液の体積を増減することによって変更できます。
11. 蛍光プローブチャネルで、ヒストグラムの最高ピーク(緑色のFL1-H、240,000 - 1,650,000、オレンジ色のFL2-H、30,000 - 165,000)に別の包括的なソフトウェアゲートを適用し、その後、その正のプローブ蛍光を密度プロットにゲートします。
12. ステップ3.1〜3.11を100%「生きた」、100%「死」、およびすべての混合培養サンプルで実行し、必要に応じて分子プローブ濃度(x 0.1〜x 10など)および/または温度とpHレベルを調整します。
13. 陽性分子プローブ蛍光シグナルの数を、「死んだ」細胞の元の細胞密度(FSC-H全体の半分または100%「死んだ」培養物から採取)と比較して、核酸プローブで染色された細胞の総割合を見つけます。
14. これを各濃度内の期間ごとに行い、非特異的染色を発生させることなく、細胞核タンパク質の取り込みを最大の割合で行うための最適なプロトコルを見つけます(データがノンパラメトリックの場合は、一元配置分散分析、分散分析、またはクラスカル-ウォリス一元配置分散分析の平均を使用します)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シアノバクテリア メディア	シグマ・アルドリッチ	C3061-500MLの	BG-11 淡水濃縮液(x50希釈)
除染液	BDバイオサイエンス	653155	高速または66μl/minの流量で出力が12イベント/秒を超える場合は、2分間実行します。続いて 2 分間のシース H2O が続きます。
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	ご要望に応じて	BDアキュリC6
シトックスグリーン	ライフテクノロジー	S7020	核酸染色 – DMSO中の5 mM溶液
シトックスオレンジ	ライフテクノロジー	S11368	核酸染色 – DMSO中の5 mM溶液