寒天井戸拡散アッセイを使用したナイシン変異体の抗菌活性の評価

要約

出典: Nickling、J.H.、 et.al。 非標準アミノ酸の選択圧取り込みにより作製する抗菌ペプチド J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオは、ナイシン変異体の抗菌活性を評価するために使用される寒天ウェル拡散アッセイを示しています。膜結合ペプチダーゼNisPを発現する ラクトコッカス・ラクティス が、 大腸菌で産生されるナイシン前駆体を活性化し、増殖阻害ハローを引き起こす様子を示しています。これらのハローのサイズは、各ナイシン変異体の生物活性を反映しています。

プロトコル

1. 抗菌活性試験

1. 無菌条件下でのGM17寒天プレートの調製
   1. プラスミドpNG nisPTを運ぶ指示株L.ラクティスNZ9000を、1%(w / v)グルコース(= GM17)および5μg/mLクロラムフェニコールを含むM17ブロス中で30°Cで一晩培養します。
   2. OD₆₀₀を測定し、新鮮な培地をOD₆₀₀ = 0.1に接種し、OD₆₀₀ = 0.4-0.6になるまでインキュベートします。次に、フラスコを氷の上に置きます。
      手記： 各 OD₆₀₀ 測定は培養量を消費します。アッセイ寒天プレートごとに、1 mLの細菌培養が必要になることに注意してください。必要に応じて、それに応じて液体培養量をスケールアップします。
   3. 1.5%寒天の場合、ガラス培地ボトルで4.5 g寒天を計量します。300 mL ddH₂Oを加え、混合し、オートクレーブします。
   4. 2x M17ブロス(2倍濃縮)を300 mL ddH₂Oに調製し、オートクレーブします。
   5. 10 μg/mLのクロラムフェニコールと2%グルコースを含む25 mLの2x M17ブロスを1 mLの L.ラクティス 前培養物(4%v/v)と混合します。
   6. 溶融した1.5%寒天培地(オートクレーブ滅菌したばかりの寒天または電子レンジで加熱したばかりの寒天培地)を25 mL加えます。
      手記： この前に、ボトルを触ると冷まします(約50°C)。 L. lactis は高温に敏感な中温性生物であるため、これは必要です。
   7. 溶液を大きなシャーレに注ぎます。プレートを10〜15分間乾燥させます。
   8. ガラスパスツールピペットの端を炎で滅菌します。冷めるのを待ってから、幅の広い端を使用して固化したGM17寒天に穴を開けます。
2. サンプル前処理
   1. 標識された1.5 mLチューブに1 mLの 大腸菌 発現培養物を取り、7,000 x gで3分間遠心分離します。残りの培地を吸引し、細胞ペレットを500 μL Na-P(50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5 Mリン酸二水素ナトリウムおよび0.5 Mリン酸水素二ナトリウムから作られたpH 7.4)に再懸濁します。
   2. 氷上でサンプルを超音波処理します。超音波処理器プローブの先端を細胞懸濁液に沈めます。超音波処理器を30%振幅に設定し、パルスを1秒オン、5秒オフで3分間設定します。
   3. 細胞ライセートを13,000 x g で10分間遠心分離して、細胞破片をペレット化します。上清を氷上の新しい反応チューブに移します。
   4. 細胞抽出物上清をNa-Pで希釈し、採取した細胞密度に対して1 mL OD₆₀₀ = 0.6に正規化します。
3. アクティビティテスト
   1. 各正規化サンプル40 μLをインジケーター寒天プレートの穴に加えます (図1)。抗菌対照化合物として400μg/mLのクロラムフェニコールを使用します。溶出バッファーをネガティブコントロールとして使用します。すべてのサンプルが寒天に拡散するまで待ちます。プレートを30°Cで一晩インキュベートします。
   2. フラットベッドスキャナーまたはデジタルカメラを使用して寒天プレートの写真を撮ります。成長阻害ハローのサイズは、手作業またはImageJを使用して測定できます。

結果

図 1.プロリン類似体を用いたSPIにより産生したナイシン変異体を含む細胞溶解物の抗菌活性アッセイ ナイシン変異体と組換え野生型サンプルとの比較すべてのサンプルは、回収された細胞培養密度に対して細胞溶解後にOD₆₀₀で正規化されました。ハローは、指標株成長阻害の形で生物活性を示します。1行目左から右へ:(4R)-フルオロプロリン、(4R)-ヒドロキシプ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸二水素ナトリウム一水和物	カール・ロス、ドイツ	K300.2
リン酸水素二ナトリウム	カール・ロス、ドイツ	P030.2
D-グルコース	カール・ロス、ドイツ	6780	溶融寒天培地に添加するための20%(w / v)溶液を調製します
クロラムフェニコール	カール・ロス、ドイツ	3886.1	L. lactisの作業濃度5 μg/mL、エタノールで37 mg/mLのストックを調製します
M17-ブロス	Sigmal-Aldrich, ドイツ	56156	市販品
寒天	カール・ロス、ドイツ	5210.5
Lactococcus lactis由来のナイシン	Sigma-Aldrich, ドイツ	N5764	市販品で、生物活性の参考として使用できます
1.5 mL エッペンドルフチューブ	Eppendorf, ドイツ	30120086
ペトリ皿(ポリスチレン、滅菌)	カール・ロス、ドイツ	TA19
ラクトコッカス・ラクティス NZ9000 pNG nisPT			細菌指標株
卓上遠心分離機、1.5 mL Eppendorf チューブ用	Eppendorf, ドイツ	5427 R
プローブ超音波処理器	Bandelin, ドイツ	ソノプルス HD3200 ソノトロード付き MS-72	最大200WのHF出力