嚢胞性線維症肺喀痰を ex vivo でエミュレートするための人工喀液培地の調製

要約

出典: Vieira、J.、 et al。 嚢胞性線維症気道マイクロバイオームに対する酸素補給の影響を研究するためのモデルの設計と開発 J. Vis. 経験。 (2021)。

このビデオは、嚢胞性線維症肺の粘度、栄養組成、およびpHを模倣した人工喀留培地の調製を示しています。得られた培地は、ex vivo研究のための生理学的に関連するプラットフォームを提供します。

プロトコル

1. 人工喀薬培地の調製

手記： ここに記載されている量は、最終的な人工喀痰培地 1 L の製造用であり、 材料表に記載されている特定の試薬を想定しています。同じ最終製品を確保するために、他の容量または異なる試薬の使用に合わせて数値を調整する必要があります。目標濃度については 、表1 を参照してください。

1. 人工喀痰化学混合物(ASCM)
   手記： ASCMは最終的な中体積の25%を占めます。保存安定性があり、まとめてまたは事前に準備できます。後で使用するために準備する場合は、化学混合物をオートクレーブし、室温で安全に保管してください。
   1. 構成化学原液を混合します。
      1. 1 M NaClストックを調製する:滅菌水1リットルあたり58.44 gのNaClを加える。
      2. 1 M KClストックを調製する:滅菌水1リットルあたり74.55 gのKClを加える。
      3. 1 M MgSO₄ ストックを調製する:滅菌水1リットルあたり246.47 gのMgSO₄・7H₂O、または滅菌水1リットルあたり120.37 gの無水MgSO₄ を加える。
      4. 1 Mグルコースストックを準備する:滅菌水1リットルあたり180.16 gのブドウ糖を加えます。
   2. 化学原液と空の250 mLボトルをオートクレーブ滅菌します。オートクレーブステップを121°Cおよび15PSIの少なくとも標準値まで30分間実行します。
   3. 空の250mLボトルに80.59mLの滅菌水を加えます。
   4. 152.30 mLの1 M NaClストックをミックスに加えます。
   5. 15.8 mLの1 M KClストックをミックスに加えます。
   6. 610 μLの1 M MgSO₄ ストックを混合物に加えます。
   7. 700 μLの1 Mグルコースストックをミックスに加えます。
2. 人工喀痰ムチンミックス(ASMM)
   手記： ASMMは最終的な中体量の50%を占めます。最終的な培地バッチと同じ日に準備されていることを確認してください。
   1. 空の1 Lボトルに450 mLの滅菌水を加えます。
   2. 50 mLの10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をボトルに加えます。
   3. 使い捨ての磁気撹拌棒をボトルに追加します。
   4. PBSと撹拌バーの入ったボトルをオートクレーブします。
   5. ムチンパウダー10gを計量し、PBSに加えます。
   6. 予備混合のためにボトルを激しく振ってください。
   7. ボトルをマグネットスターラー付きのホットプレートの上に置きます。火を中火から強火に設定し、50°Cを目標に、攪拌速度を1100rpmにします。バーが磁石から飛び出さないように、速度を徐々に上げます。
      1. 加熱し、15分間かき混ぜます。
      2. 耐熱手袋でボトルを手に取ってください。ムチンパウダーが溶液から沈殿するかどうかを観察してください。
      3. ムチンパウダーが完全に溶解していない場合は、完全に溶解するまで5分間間隔でボトルを加熱/攪拌機に戻します。
   8. ムチン混合物を室温まで冷まします。
3. 人工喀ぱく生物学的混合物(ASBM)
   手記： ASBMは最終的な中体量の25%です。最終的な培地バッチと同じ日に準備し、他の混合物とは異なり、その成分を熱にさらさないでください。
   1. 100倍のビタミンストックを4°Cの冷蔵庫または氷の上で解凍します。​
      手記： ビタミンストックを10mLのアリコートに事前に分配して、凍結/融解サイクルの数を最小限に抑えます。
   2. オートクレーブ滅菌した空の250mLボトルに124.24mLの滅菌水を加えます。
   3. 25.76 mLの50x必須アミノ酸ストックをミックスに加えます。
   4. 80.14 mLの100x非必須アミノ酸ストックをミックスに加えます。
   5. (解凍した)100倍ビタミンストック10mLをミックスに加えます。
   6. 1 mLの1000倍微量金属ストックをミックスに加えます。
   7. 8.33 mLの30%卵黄エマルジョンを混合物に加えます。
   8. 400 μLの10 g / Lフェリチンストックをミックスに加えます。
   9. 手動振とうで溶液をよく混合します。
4. 人工喀痰培地(ASM)
   1. ASMMの入った1Lボトルに250mLのASCMを加えます。
   2. 250 mLのASBMを培地ボトルに加えます。
   3. 塩基性MOPSバッファー(1 M)で培地を滴定し、狭い範囲のpHペーパーでpHを6.3にします。滴定の前に、中程度の混合物は酸性になりすぎます。
   4. 得られた人工喀痰培地をろ過の準備が整うまで4°Cで冷蔵します。
   5. ろ過プロセスを開始するには、200 mLのろ過されていない人工喀痰培地を、0.22μmの孔径フィルターを備えた真空ろ過システムに移します。
   6. ろ過システムを真空ポンプに接続し、真空ポンプの電源を入れて70 mbarに設定し、4°Cの冷蔵室で90 rpmで振とうオービタルシェーカーにチャンバーを置きます。
      1. かなりの量がろ過されるので、さらに150 mLの培地を補充します。1 Lの培地を完全にろ過するには1〜2日かかります。
      2. すべての媒体がろ過されるまで、追加のチャンバーで繰り返します。
         手記： ムチンは時間の経過とともにフィルターを詰まらせるため、同じ0.22 μmフィルターで350 mLを超える培地をろ過しないようにしてください。
   7. ろ過した人工喀痰培地を、使用する準備ができるまで4°Cで冷蔵します。最良の結果を得るには、準備から1か月以内にASMを使用してください。

表1:文献のレビューから導き出された人工喀が媒体のレシピ。(コラム1)人工有酸素媒体の製剤における試薬と主要値。(2-7番目の列)現存する文献からのレシピの比較。(8-9番目の列)。

列 1		コラム2	コラム3	コラム4	コラム5	コラム6	コラム7	コラム8	コラム9
価値		コムストック	キルヒナー	スリラムル	パーマー	フリン	ギャラガー	ライ	源
ムチン		2% w/v	0.5% w/v	0.5% w/v	-	1% w/v	2% w/v	1% w/v	フリン
塩化ナトリウム		85.5ミリメートル	85.5ミリメートル	85.5ミリメートル	66.6ミリメートル	89.8ミリメートル	85.5ミリメートル	152.3ミリメートル	ラピエール
塩化カリウム		29.5ミリメートル	29.5ミリメートル	29.5ミリメートル	15.8ミリメートル	-	2.95ミリメートル	15.8ミリメートル	パーマー
硫酸マグネシウム		-	-	-	0.6ミリメートル	1ミリメートル	1ミリメートル	0.61ミリメートル	パーマー
硫酸鉄		-	-	-	0.0036ミリメートル	-	-	-	-
塩化アンモニウム		-	-	-	2.3ミリメートル	60ミリメートル	-	-	-
リン酸一カリウム		-	-	-	2.5ミリメートル	60ミリメートル	-	-	-
グルコース		-	-	-	3.2ミリメートル	13ミリメートル	40ミリメートル	0.7ミリメートル	サンベーク
乳酸		-	-	-	9ミリメートル	-	-	-	-
必須アミノ酸		14.45倍	0.25 g / L	0.25 g / L	酸あたり	0.5倍	0.375倍	1.29倍	パーマー
非必須アミノ酸		28.9倍	0.25 g / L	0.25 g / L	酸あたり	0.25倍	0.5倍	8.01倍	パーマー
ビタミン		-	-	-	-	-	1倍	1倍	ギャラガー
微量金属		-	-	-	-	1倍	1倍	1倍	フリン
卵黄		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	キルヒナー
フェリチン		0.0003 グラム/リットル	-	-	-	-	0.0004 g/L	0.0004 g/L	ギャラガー
サケ精子DNA		1.4 g / L	4 g / L	4 g / L	-	-	1.4 g / L	-	-
DPTAの		-	-	0.0059 グラム/リットル	-	-	-	-	-
pH(酸塩酸塩)		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	ラピエール
貯蔵		0	4°	-	-	4°	4°	4°	キルヒナー
殺菌		オートクレーブ	フィルター	オートクレーブ	-	オートクレーブ	オートクレーブ	フィルター	キルヒナー

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BMEビタミン(100x)ソリューション	ミリポアシグマ	B6891	ビタミン補給の濃縮溶液。
クリンパー、30 mm	DWKライフサイエンス	224307	アルミシールを血清ボトルに取り付けるためのクリンパー。
D-(+)-グルコース	ミリポアシグマ	G7021	固体グルコース粉末(右旋性異性体)。
ダイヤフラムポンプ ME 2 NT	VACUUBRANDの	20730003	真空ろ過用真空ポンプ。
卵黄エマルジョン	ハイメディア	FD045	生理食塩水中の30%卵黄の滅菌エマルジョン。
フェリチン、馬の脾臓からカチオン化	ミリポアシグマ	F7879	フェリチン(鉄貯蔵タンパク質)溶液。
FIREBOYプラスセーフティブンゼンバーナー	インテグラ・バイオサイエンス	144000	ユーザーインターフェースと安全機能を備えたブンゼンバーナー。
ハイドリオンpHペーパー(1.0–14.0)	マイクロエッセンシャルラボ	94	1.0〜14.0の範囲のpH試験紙。
ハイドリオンpHペーパー(4.0–9.0)	マイクロエッセンシャルラボ	55	4.0〜9.0の範囲のpH試験紙。
ハイドリオンpHペーパー(6.0–8.0)	マイクロエッセンシャルラボ	345	6.0〜8.0の範囲のpH試験紙。
皮下注射針-Pro EDGE安全装置、18 g	スミスメディカル	401815	安全キャップ付き18G針。
インライン圧力計	ミリポアシグマ	20469	ボトル圧力を監視するためのガス圧力計。
Innova 42 インキュベートシェーカー	エッペンドルフ	2231000756	コンビネーションインキュベーター/オービタルシェーカー。
ルアーロック注射器(針付き)	ベクトン・ディキンソン	309580	3 mLシリンジと18 G針の組み合わせ。
ルアーバルブの品揃え	世界の精密機器	14011	ガスフローチューブ用バルブ。
LSEオービタルシェーカー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	6780-NP	ろ過中に媒体を撹拌するオービタルシェーカー。
硫酸マグネシウム七水和物	ミリポアシグマ	M2773	固体エプソム塩(硫酸マグネシウム七水和物)。
流量計付き医療用空気単段レギュレータ	西洋企業	M1-346-15FMの	15L/minメーターの空気流量調整器。
MEMアミノ酸(50x)溶液	ミリポアシグマ	M5550	必須アミノ酸の濃縮溶液。
MEM非必須アミノ酸(100倍)溶液	ミリポアシグマ	M7145	非必須アミノ酸の濃縮溶液。
Millex-GPフィルター、0.22 μm	ミリポアシグマ	SLMP25SS	0.22 μmポリエーテルスルホンメンブレン滅菌シリンジフィルター。
ミリQアカデミック	ミリポアシグマ	ZMQS60E01	Milli-Q滅菌水ろ過システム。
MiniOX 3000酸素モニター	MSAの	814365	ガス流量酸素パーセンテージモニター。
MOPSバッファー(1 M、pH 9.0)	ボストンバイオプロダクツ	BBM-90	培地のpHを調整するためのMOPSバッファー。
豚の胃からのムチン	ミリポアシグマ	M2378	ムチン(グリコシル化ゲル形成タンパク質)粉末。
塩化カリウム	ミリポアシグマ	P9541	固体塩化カリウム塩。
PTFE使い捨て撹拌棒	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14-513-95	使い捨ての磁気撹拌棒。
PTFEスレッドシールテフロンテープ	VWRの	470042-938	ガス系接続を補強するためのテフロンテープ。
Q-Gard 2 精製カートリッジ	ミリポアシグマ	QGARD00D2	Milli-Qシステム用精製カートリッジ。
再利用可能なメディア保存ボトル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	06-423A	培地を混合・保存するためのボトル。
ラバーストッパー、30 mm、グレーブロモブチル	DWKライフサイエンス	224100-331	血清ボトル用ゴム栓。
成形目盛り付き血清ボトル、500 mL	DWKライフサイエンス	223952	密封培養用のガラス血清ボトル。
小口径エクステンションセット	ブラウンメディカル	471960	ルアーロックコネクタ付きチューブ延長。
塩化ナトリウム	ミリポアシグマ	S3014	固体塩化ナトリウム塩。
微量金属混合物、1000倍	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NC0112668	生理的微量金属の濃縮溶液
裏地なしアルミニウムシール、30 mm	DWKライフサイエンス	224187-01	ゴム栓の上に圧着されたアルミニウムシール。